[发明专利]一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法

权利要求书

1.一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

以杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA为模板，加入上游引物和下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；

将所述扩增产物进行凝胶电泳，EB染色后，置于凝胶成像系统内成像；

根据成像结果统计带型；

根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度。

2.根据权利要求1所述的一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列为5'-GAAATTACGTGGCTGCCATT-3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'-GGTAGTTTTGGCCCTCACAA-3'。

3.根据权利要求1所述的一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，其特征在于，采用改良热碱法提取杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA，所述改良热碱法包括：

将所述西葫芦子叶剪碎置于离心管中，向离心管中加入NaOH，将离心管在沸水中放置预定时间，向离心管中加HCl中和，将离心管放置于Tris-HCl进行沸水浴，得到所述杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA。

4.根据权利要求1所述的一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，其特征在于，在所述以杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA为模板，加入上游引物和下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物的步骤之前，还包括：

提取西葫芦叶片基因组DNA；

以所述西葫芦叶片基因组DNA中母本材料和父本材料的基因组DNA为模板，采用SSR分子标记进行PCR扩增，筛选出可以在亲本材料之间呈现出多态性扩增的上游引物和下游引物。

5.根据权利要求1所述的一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增为多态性扩增。

6.根据权利要求1所述的一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增中PCR反应体系包括10μL的2×taq mix，0.4μL的所述上游引物，0.4μL的所述下游引物，2μL的所述杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA，加水至20μL。

7.根据权利要求1所述的一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增中PCR反应过程包括：

依次在94℃温度条件下反应5min，94℃温度条件下反应30s，56℃条件下反应30s，72℃条件下反应15s，循环33次；

72℃温度条件下反应10min，最后温度4℃条件下保存。

8.根据权利要求1所述的一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，其特征在于，所述将扩增产物进行凝胶电泳包括：

将5μL所述扩增产物于1％琼脂糖凝胶上160V恒压电泳15min。

9.根据权利要求1所述的一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，其特征在于，所述根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度的公式为：

西葫芦杂交种子的纯度(％)＝扩增出两条带的种子数目/待测种子数目*100％。