[发明专利]一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法

说明书

本申请公开一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，方法包括：以杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA为模板，加入上游引物和下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物进行凝胶电泳，EB染色后，置于凝胶成像系统内成像；根据成像结果统计带型；根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度。由于分子标记技术直接从DNA水平揭示双亲的差异性，因此实验结果准确，可靠，而且可以在苗期甚至种子水平进行鉴定，因此大大缩短了实验周期。与传统方法相比，本申请基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法可以准确鉴定杂交种纯度，不受环境影响；在苗期即可鉴定纯度，显著缩短鉴定周期。

技术领域

本发明涉及生物标记技术领域，特别涉及一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法。

背景技术

西葫芦是一种重要的瓜类蔬菜，不仅产量高，耐储运，而且还有很高的营养价值及保健功能，栽培面积仅次于黄瓜。西葫芦杂交种目前在中国市场占据一定份额，而种子纯度鉴定是商业化育种的必备环节。西葫芦杂交种主要利用通过人工去雄授粉制备，此过程难免造成自花授粉而产生伪杂种，因此，杂交种纯度鉴定尤其重要。传统的鉴定方式主要通过观察种子形态鉴定及植株田间表型等，但鉴定周期长，用地多，成本高且易受环境因素影响，准确性难以保证。

发明内容

本发明实施例提供一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，解决传统通过种子形态鉴定、田间表型鉴定等产生准确率低和周期长的问题。

本申请实施例示出了一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

以杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA为模板，加入上游引物和下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；

将所述扩增产物进行凝胶电泳，EB染色后，置于凝胶成像系统内成像；

根据成像结果统计带型；

根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度。

进一步地，所述上游引物的核苷酸序列为5'-GAAATTACGTGGCTGCCATT-3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'-GGTAGTTTTGGCCCTCACAA-3'。

进一步地，采用改良热碱法提取杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA，所述改良热碱法包括：

将所述西葫芦子叶剪碎置于离心管中，向离心管中加入NaOH，将离心管在沸水中放置预定时间，向离心管中加HCl中和，将离心管放置于Tris-HCl进行沸水浴，得到所述杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA。

进一步地，在所述以杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA为模板，加入上游引物和下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物的步骤之前，还包括：

提取西葫芦叶片基因组DNA；

以所述西葫芦叶片基因组DNA中母本材料和父本材料的基因组DNA为模板，采用SSR分子标记进行PCR扩增，筛选出可以在亲本材料之间呈现出多态性扩增的上游引物和下游引物。

进一步地，所述PCR扩增为多态性扩增。

进一步地，所述PCR扩增中PCR反应体系包括10μL的2×taq mix，0.4μL的所述上游引物，0.4μL的所述下游引物，2μL的所述杂交西葫芦叶片单株的基因组DNA，加水至20μL。

进一步地，所述PCR扩增中PCR反应过程包括：

依次在94℃温度条件下反应5min，94℃温度条件下反应30s，60℃条件下反应30s，7 2℃条件下反应15s，循环33次；

72℃温度条件下反应10min，最后温度4℃条件下保存。

进一步地，所述将扩增产物进行凝胶电泳包括：