[发明专利]一种基于非标记、非固定化的电化学磁性生物传感器检测5-羟甲基胞嘧啶的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断用途的基于电化学磁性生物传感器检测5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于：基于末端转移酶和Ru(III)氧化还原循环的双信号放大策略，利用以丝网印刷碳电极的电化学磁性生物传感器定量分析5-羟甲基胞嘧啶；具体步骤为：DNA链中5-羟甲基胞嘧啶位点的生物素化；具有链霉亲和素包被的磁珠富集生物素化的5-羟甲基胞嘧啶DNA链；末端转移酶催化聚合生物素化的5-羟甲基胞嘧啶DNA链的延伸；加入Ru(NH₃)₆³⁺/Fe(CN)₆^3-体系产生增强的电催化信号；电化学磁性生物传感器定量分析。

2.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，用半胱氨酸-生物素进行一步亚硫酸氢盐介导的DNA链中5-羟甲基胞嘧啶位点的生物素化。

3.根据权利要求2所述的定量分析方法，其特征在于，将半胱氨酸-生物素和双链DNA混合加入Na₂S₂O₅溶液，42～45℃下孵育48～50小时，待溶液冷却至室温，调节pH值，在室温下反应5～10分钟后，将样品通过Micro-Bio-Spin P6柱除去过量的半胱氨酸-生物素和盐，即得。

4.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，在末端转移酶反应体系中催化聚合生物素化的5-羟甲基胞嘧啶DNA链的延伸；所述末端转移酶反应体系包括1×TdT缓冲液、CoCl₂溶液、dNTPs和末端转移酶。

5.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，Ru(NH₃)₆³⁺/Fe(CN)₆^3-体系包括1～1.5mM PBS缓冲液，0.1～0.5M NaCl，27～30μM Ru(NH₃)₆³⁺和2～5mM Fe(CN)₆^3-。

6.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，电化学磁性生物传感器利用0至-500mV，脉冲幅度为50mV，脉冲宽度为50ms的差分脉冲伏安法来记录电化学响应，参比电极为Ag/AgCl。

7.根据权利要求1～6任一所述的定量分析方法在各种非疾病诊断目的的组织、细胞以及各种核酸序列中5-羟甲基胞嘧啶分析检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，5-羟甲基胞嘧啶为基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶；所述细胞为人宫颈癌细胞系、人胚胎肾细胞系。

9.一种定量分析5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒，其特征在于，包括半胱氨酸-生物素、Na₂S₂O₅溶液、链霉亲和素包被的磁珠、洗涤缓冲液、末端转移酶反应液、Ru(NH₃)₆³⁺/Fe(CN)₆^3-体系反应液和丝网印刷碳电极；

所述洗涤缓冲液包括：0.5M NaCl、20mM tris-HCl和1mM EDTA，tris-HCl pH值为7.4；

末端转移酶反应液包括1×TdT缓冲液、0.25mM CoCl₂溶液、dNTPs和末端转移酶；

Ru(NH₃)₆³⁺/Fe(CN)₆^3-体系反应液包括：1～1.5mM PBS缓冲液，0.1～0.5M NaCl，27～30μM Ru(NH₃)₆³⁺和2～5mM Fe(CN)₆^3-；试剂盒使用方法如权利要求1所述。