[发明专利]一种基于非标记、非固定化的电化学磁性生物传感器检测5-羟甲基胞嘧啶的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非疾病诊断用途的基于非标记、非固定化的电化学磁性生物传感器检测5‑羟甲基胞嘧啶的方法。基于末端转移酶和Ru(III)氧化还原循环的双信号放大策略，利用以丝网印刷碳电极的电化学磁性生物传感器定量分析5‑羟甲基胞嘧啶。具体步骤为：DNA链中5‑羟甲基胞嘧啶位点的生物素化；具有链霉亲和素包被的磁珠富集生物素化的5‑羟甲基胞嘧啶DNA链；末端转移酶催化聚合生物素化的5‑羟甲基胞嘧啶DNA链的延伸；加入Ru(NH₃)₆³⁺/Fe(CN)₆^3‑体系产生增强的电催化信号；电化学磁性生物传感器定量分析。该方法最低检测限可达9.06fM。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非疾病诊断用途的基于非标记、非固定化的 电化学磁性生物传感器检测5-羟甲基胞嘧啶的方法。

背景技术

与5-甲基胞嘧啶(5-mC)测定相比，5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的准确定量仍然是一个巨大的挑战，因为它具有相对较低的丰度和与更丰富的5-甲基胞嘧啶具有相似性。亚硫酸氢盐测序方法被认为是5-甲基胞嘧啶测定的标准，但它具有无法区别5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的缺点。目前，已经开发出用于基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶测定的各种方法，例如单分子实时(SMRT)测序、液相色谱/串联质谱(LC/MS-MS)、高效液相色谱(HPLC)，薄层色谱(TLC)，酶放射性糖基化标记和免疫测定，这些方法可以有效区分5-羟甲基胞 嘧啶和5-甲基胞嘧啶。

由于具有低成本，便携性和高灵敏度的优点，基于酶修饰的电化学生物传感器已被用 于检测低丰度(pM级别)的5-羟甲基胞嘧啶。然而，基于酶修饰的方法需要昂贵的受DNA 序列限制的酶、合成酶辅因子/底物的类似物，以及繁琐的碱基修饰步骤。为了克服这些限 制，已经开发了一种电致化学发光(ECL)生物传感器，基于KRuO₄可以将5-羟甲基胞嘧啶特异性氧化至5-甲酰基胞嘧啶(5-fC)来量化5-羟甲基胞嘧啶-DNA，然后用电致化学发光(ECL)发光分子N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)标记。最近，Bayley小组发 现了一种替代方法，其中5-羟甲基胞嘧啶是用生物素原位一步化学修饰的，可以富集稀有 的含5-羟甲基胞嘧啶的序列并用蛋白质纳米孔进行鉴定。然而，这些方法仅作为概念证明， 它们并不适用于检测基因组DNA中的5-羟甲基胞嘧啶。

发明内容

针对5-羟甲基胞嘧啶检测存在的问题，本发明提供一种基于非标记、非固定化的电化 学磁性生物传感器检测5-羟甲基胞嘧啶的方法。本发明采用末端转移酶(TDT)和Ru(III) 氧化还原循环的双信号放大策略，利用非标记、非固定化电化学磁性生物传感器准确定量 基因组DNA中的5-羟甲基胞嘧啶的电化学方法。

本发明采用以下技术方案：

本发明第一个方面，提供一种非疾病诊断用途的基于电化学磁性生物传感器检测5-羟 甲基胞嘧啶的定量分析方法，基于末端转移酶和Ru(III)氧化还原循环的双信号放大策略， 利用以丝网印刷碳电极(SPCE)的电化学磁性生物传感器定量分析5-羟甲基胞嘧啶。

进一步的，所述非疾病诊断用途的基于电化学磁性生物传感器检测5-羟甲基胞嘧啶的 定量分析方法具体步骤为：DNA链中5-羟甲基胞嘧啶位点的生物素化；具有链霉亲和素包 被的磁珠(MB)富集生物素化的5-羟甲基胞嘧啶DNA链；末端转移酶催化聚合生物素化5-羟甲基胞嘧啶DNA链的延伸；加入Ru(NH₃)₆³⁺/Fe(CN)₆^3-体系产生增强的电催化信号；电化学磁性生物传感器定量分析。

进一步的，用半胱氨酸-生物素进行一步亚硫酸氢盐介导的DNA链中5-羟甲基胞嘧啶 位点的生物素化。