[发明专利]一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法

说明书

本发明涉及一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法，包括以下步骤：(1)收集NK细胞培养基上清液，并用磷酸盐缓冲液进行稀释，得到稀释液；(2)将稀释液依次在低转速和高转速下离心，且每次离心后取上清液弃沉淀；(3)将离心上清液置于超滤管中进行离心，取上清液，得到的浓缩上清液进行超高速离心，超高速离心后取沉淀；(4)将步骤(3)超高速离心后得到的沉淀置于磷酸盐缓冲液中并转移至透析袋中进行透析，即得所述NK细胞exosomes。与现有技术相比，本发明粒径分布均匀，且表面携带标志性蛋白CD9、CD81、CD63，克服了现有制备技术存在纯度低，产量低，表征蛋白表达量低等不足，且可以直接用于后续的检测，安全系数高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法。

背景技术

exosomes是由很多类型细胞分泌的30-150nm的“杯托状”磷脂双分子层囊泡，密度为1.13-1.19g/mL，携带多种蛋白质、脂质和核酸，功能复杂，参与免疫调节、调控细胞外基质重构、激活细胞的信号通路等。在癌症研究中，以前的研究多数是探索癌细胞释放的exosomes，但很少了解免疫细胞释放的exosomes的功能。NK细胞对转移性及血液恶性肿瘤具有天然快速免疫作用，NK细胞的抗肿瘤特性已经在临床实验阶段。然而活细胞治疗会带来固有的风险：如微血管阻塞导致肺栓塞和死亡、移植细胞转化为不良的细胞类型或癌症、免疫排斥反应、心律失常、骨化和/或钙化等。用exosomes替换细胞治疗可以避免这些问题，例如由于exosomes的小尺寸可以避免血管闭塞和不良细胞类型的产生，目前有研究(如：Zhu L et al.Theranostics,2017,7(10):2732-2745)表明NK细胞exosomes对肿瘤细胞具有细胞毒性，但是对正常细胞无影响，值得进一步研究将其发展为癌症的治疗手段。若要将NK细胞exosomes开发应用，NK细胞exosomes的高纯度大规模生产是不可回避的一环。传统的超高速离心得到的exosomes纯度尚可，但其产量不高，而根据exosomes尺寸原理设计的超滤，透析等方法又不能很好的去除与exosomes尺寸一致的杂蛋白，而聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法和免疫磁珠法都不同程度地引入不适合临床治疗的外源性物质。虽然目前也有报道大规模NK细胞exosomes的提纯方法(如：Jong A Y,et al.[J].Journal of Extracellular Vesicles,2017,6(1):1294368)。但NK细胞exosomes的纯度和产量问题并没有同时得到很好的解决，因此目前缺少一个能提取高纯度，高产率，高生物活性临床级别NK细胞exosomes的稳定方法。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种纯度高的临床级NK细胞exosomes可控规模化的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法，包括以下步骤：

(1)收集NK细胞培养基上清液，并用磷酸盐缓冲液进行稀释，得到稀释液；

(2)将稀释液依次在低转速和高转速下离心，且每次离心后取上清液弃沉淀，在高转速下离心后得到离心上清液；

(3)将离心上清液置于超滤管中进行离心，取上清液，得到的浓缩上清液进行超高速离心，超高速离心后取沉淀；

(4)将步骤(3)超速离心后得到的沉淀置于磷酸盐缓冲液中重悬稀释并转移至透析袋中进行透析，将超小分子杂质透析出去，即得所述纯化的NK细胞exosomes。