[发明专利]检测EGFR基因T790M、C797S及L798I位点的特异性探针及试剂盒

说明书

本发明公开了检测EGFR基因T790M、C797S及L798I位点的特异性探针及试剂盒，所述特异性探针为核酸序列并包含非配对区、突变检测区、配对区；非配对区和配对区的碱基序列分别与待测位点的特异性序不配对和配对；突变检测区的碱基种类与待测位点的突变位点突变前或突变后的碱基种类相配对；所述非配对区的一个碱基修饰有第一修饰基团，配对区的第一个碱基修饰有第二修饰基团；第一修饰基团和第二修饰基团为相配合的荧光基团和淬灭基团。本发明提供的特异性探针及试剂盒，具有高灵敏度、高特异性，并对假阳性现象有强烈抑制的特点，可帮助肿瘤病人进行微创的基因突变检测，在肿瘤早筛，用药指导及预后监测等方面有重要作用的临床应用。

技术领域

本发明涉及基因突变检测技术领域，尤其涉及检测EGFR基因T790M、C797S及L798I位点的特异性探针及试剂盒。

背景技术

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是酪氨酸激酶家族成员，同时是原癌基因HER-1的表达产物。EGFR作为介导表皮生长因子(EGF)，同时也是启动细胞增殖和信号传导的重要受体，其在体细胞中的基因突变或者表达异常，与诸多实体瘤的发生发展紧密相关，特别是非小细胞肺癌。数据显示，40％以上中国的非小细胞肺癌患者存在EGFR基因突变。对于EGFR基因突变引起的肺癌，国际上公认的治疗方案是采用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)进行治疗。研究表明，EGFR的不同突变类型将改变TKI制剂的敏感性。因此，在肺癌患者的治疗中，针对EGFR基因突变的靶标检测及靶向治疗，对于患者在治疗中的受益至关重要。

研究还发现，部分EGFR-TKI初始有效的患者后期会发生耐药，该现象与EGFR 20号外显子的T790M、C797S突变的产生密切相关。即以上EGFR基因突变位点对使用了第一代、第二代酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如厄洛替尼和吉非替尼会产生抗性，从而发生耐药现象，临床提示需要更换第三代TKI药物如AZD9291进行治疗。更进一步来说，C797S与T790M在体内的顺/反式突变直接关系到了采用一代与三代联合TKI能否解决突变组合带来的药物结合受阻问题。最新数据显示，当针对EGFR的T790M突变位点的第三代不可逆转的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)使用后，仍将出现耐药现象，即EGFR的L798I和C797S作为继发性耐药基因突变位点，可导致第一、第三代EGFR-TKI耐药。

目前在临床上，EGFR的突变检测大部分是基于肿瘤的组织样本，而肿瘤组织样本大部分来源自穿刺和活检钳活检，该技术作为一种有创检测，一方面给病人带来极大的痛楚，另一方面在后期由于样本难以获取，导致无法对病人靶向用药的情况进行实时监测。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是肿瘤患者体内从肿瘤细胞释放到外周血循环中的肿瘤DNA，可作为一种新的肿瘤标志物,代替肿瘤组织样本检测，从而对肿瘤的早期筛查、鉴定、预后和治疗检测方面具有重要意义。有研究表明，在对癌症患者治疗过程中进行多次的液体活检，发现检测ctDNA可以预测治疗结果，如对术后化疗的抗性，并且在一些情况下比传统临床方法能更提早发现复发情况，使得患者在治疗中受益。而目前针对ctDNA液体活检技术大多操作复杂，具有强烈的仪器依赖性，不适用于大规模临床推广。

基于此现状，有必要提供一种可针对上述3个EGFR基因位点的检测试剂，其检测下限低，特异性高，能够在EGFR-TKI治疗过程中实时、定量监测ctDNA上T790M、C797S及L798I位点的突变及其变化情况，指导患者及时更换治疗方案，便于患者从EGFR-TKI的治疗中受益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可针对上述3个EGFR基因位点的检测试剂，其检测下限低，特异性高，能够在EGFR-TKI治疗过程中实时、定量监测ctDNA上T790M、C797S、L798I位点的突变及其变化情况，指导患者及时更换治疗方案，便于患者从EGFR-TKI的治疗中受益。