[发明专利]一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法

说明书

本发明提供了一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法。本发明提供的引物、TaqMan‑MGB探针和检测方法，可实现快捷、简便、灵敏、准确的监测kdr等位基因类型、基因型频率等，即可快速准确的掌握淡色库蚊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态。因此，本发明提供的引物、TaqMan‑MGB探针、试剂盒和检测方法，是一种能准确、方便预测淡色库蚊抗药性发生和发展的新产品和新方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法。

背景技术

淡色库蚊(Culex pipienspallens)是淋巴丝虫病的主要传播媒介，同时作为流行性乙型脑炎的次要传播媒介，其危害不容视。由于近年来全球气候的变化，城市及区域间的贸易和人员交流繁，生态环境的变迁和化学杀虫剂的过量使用等，使得病媒生物的种群密度和分布发生新的变化，并伴随着新发病媒生物性传染病出现，针对病媒生物密度和抗药性的调查研究对于发现病媒生物的异常变化，减少病媒生物对于人群的骚扰和危害，指导化学杀虫剂的科学使用，防控病媒生物性疾病的发生和流行意义重大。

目前，蚊类抗药性的检测方法，一致沿用1970世界卫生组织推荐的生物测定法，测出害虫对药剂的敏感毒力基线和LD50或LC50值。再从测试地区采集同种害虫种群，采用与测定敏感品系相同的生物测定方法和控制条件，得出待测种群的LD50或LC50值，以待测种群与民敏感种群品系的LD50或LC50值之间的比值来表示抗性水平。但该方法对所获得资料有严格的统计要求，必须严格控制实验条件，需反复多次实验，而且在实践中也显示出较明显的局限性。传统的生物测定法比较繁琐，从虫源、饲养到测定难于做到真正的标准化，而且由LD-p线求出的LD50或LC50值的重复性和精确性较低，当群体抗性较低和抗性种群多样时很难准确测定，因此测得的抗性水平往往具有滞后性，不适合早起抗性检测，不利于制定相应的防治对策。

鉴于目前许多抗性对策依赖于抗性的早期检测，因此抗性监测与检测技术的研究尤为重要。随着抗性监测和检测目的的多元化，抗性监测手段和方法也朝着多元化方向发展。害虫抗药性分子检测技术是基于对害虫抗药性机制了解的基础上建立起来的，即利用分子生物学技术检测杀虫剂作用靶标的抗性位点或解毒代谢酶基因的增强表达。基于可操作性、实用性和经济等方面的原因，目前几乎所有的抗性检测研究都集中于靶标抗性方面，即检测靶标基因的突变。

kdr基因可以作为昆虫对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态。多项数据表明发现LC50为代表的高效氯氰菊酯抗性与淡色库蚊kdr等位基因频率之间存在正相关关系。研究说明Kdr基因可以作为淡色库蚊对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，可以预测抗性的发生和发展。

发明内容

本发明提供了一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法，可实现快捷、简便、灵敏、准确的监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，是一种准确、方便预测淡色库蚊抗药性发生和发展的新方法。

本发明的一个目的是提供一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的专用引物对，所述引物对由F和R组成，所述F具有序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列，所述R具有序列表中SEQ ID№：2所示核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的探针，所述探针包括下述1)-6)中的至少一种：

1)探针P1具有序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列；

2)探针P2具有序列表中SEQ ID№：4所示核苷酸序列；

3)探针P3具有序列表中SEQ ID№：5所示核苷酸序列；