[发明专利]一种转Sm1-chit42木霉工程菌构建及其应用

说明书

本发明公开了一种转Sm1‑chit42木霉工程菌构建及其应用；本发明采用哈茨木霉菌T.harzianumT30菌株作为载体，选择其具有激活植物抗病性功能的几丁质酶Chit42基因及疏水蛋白Sm1基因，根据结构生物学和生物信息学原理，对融合基因的过表达进行定向分子设计，构建能够表达融合蛋白的Sm1‑Chit42木霉工程菌，将发酵液制成工程蛋白粗提物原粉。本发明的工程蛋白粗提物原粉能有效防治黄瓜白粉病，并对黄瓜植株具有促进生长的作用；苗期喷洒工程蛋白制剂可提高防效。

技术领域

本发明涉及一种转Sm1-chit42木霉工程菌构建、粗提物的制备方法及其防治黄瓜白粉病等方面的应用。

背景技术

木霉菌是土壤和根际生态系统中普遍存在有益真菌，木霉定植植物根际土壤和根部后可以诱导农作物对侵染性病害和非生物胁迫的抗性，并提高作物对土壤营养吸收和利用能力。另一方面，木霉菌定植植物叶片后，可通过一系列细胞壁降解酶(如、几丁质酶Chit42、Chit33和β-1，3-葡聚糖酶直接降解所接触的病原菌细胞壁，完成重寄生过程；同时，木霉菌也可分泌激发子类蛋白，如几丁质酶、疏水蛋白等诱导植物叶片防御反应的激发子蛋白，诱导宿主植物产生对病原菌侵染的抗性。

目前研究已表明，木霉菌Sm1蛋白(small one protein)是从Trichoderma virens中分离得到的一种低分子量、富含半胱氨酸的疏水性蛋白，属于蛋白类激发子，与Cerato-platanin基因家族有很高的同源性，cDNA全长为417bp，编码138个氨基酸，具有诱导植物免疫抗性的作用。该小蛋白分子对植物和微生物无毒，能诱导棉花、水稻活性氧的释放以及葡聚糖酶、几丁质酶和过氧化物酶等防御反应基因的局部和系统表达。木霉菌可通过Sm1激发子识别植物或真菌细胞壁寡糖，诱导植物的免疫反应。木霉菌几丁质酶(Chitiniase)能够降解植物病原真菌细胞壁的几丁质成分，使其细胞壁变薄，生长和繁殖速度减慢，在重度降解后，病原菌细胞甚至会出现畸形、原生质外泄和死亡的现象。且几丁质酶可诱导植物抗性，参与对植物碳水化合物代谢和植物生长发育的调控。

通过转基因的方法构建转化木霉菌源的单一几丁质酶基因工程菌已有报导，但构建木霉菌源疏水小蛋白Sm1和绿僵菌源几丁质酶chit42基因的双价工程菌，国内外无报导。双价工程菌可使木霉菌诱导植物抗性和降解病原菌的功能最大化，并有潜在抑虫活性。构建这种定向表达的双价工程菌，萃取其高效表达的融合蛋白，制备植物免疫新型蛋白农药，其防病促生功能超出了单一工程蛋白或野生株蛋白的效果。该类蛋白无毒、无害、无污染，将成为未来农业植物保护工程蛋白开发趋势。

发明内容

本发明的目的在于构建双价生防基因(Sm1-chit42)共表达工程菌和工程菌粗提物制备方法，验证了工程菌粗提物诱导防治白粉病功能，具体是提供了一种转Sm1-chit42木霉工程菌构建及其应用。通过构建Sm1-Chit42融合基因表达框，经双酶切法构建过表达载体，并转化木霉菌，获得Sm1-Chi42融合基因过表达工程菌。工程菌的粗提物能够有效防治黄瓜白粉病，并对黄瓜植株具有促进生长的作用。本发明为新型木霉菌工程蛋白农药的开发提供技术支撑。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种融合基因过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42，所述融合基因过表达载体是通过融合PCR的方法，将TrpC启动子序列、TrpC终止子序列和Sm1-Chi42基因融合成表达框，并通过双酶切的方法构建而得的。

所述融合基因过表达载体的具体构建方式如下：

以Sm1-F SEQ ID No：4、Sm1-R SEQ ID No：5为引物扩增Sm1(SEQ ID No：3)序列；

以SEQ ID No：7、SEQ ID No：8为引物扩增Chit42(SEQ ID No：6)序列；