[发明专利]一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法

说明书

一种利用环糊精水解酶纯化γ‑环糊精的方法，属于环糊精加工技术领域。本发明以淀粉或糊精为底物，用缓冲溶液配置一定浓度的底物溶液，加入一定量以γ‑CD为产物的环糊精葡萄糖基转移酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，灭酶；以上述反应液为底物，向其中加入一定量的环糊精水解酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后灭酶。本发明利用了一种对环糊精具有选择降解能力的环糊精水解酶，利用其对于α‑CD和β‑CD具有较高的降解能力，而对γ‑CD具有较弱的降解能力，选择性的除去α‑CD和β‑CD，保留γ‑CD，从而提高γ‑CD的纯度。本发明突破了以往工业上大多采用有机溶剂沉淀的方法，采用酶法纯化γ‑环糊精的方法，操作简单，绿色环保，在环糊精加工领域具有良好的应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，特别涉及一种在环糊精葡萄糖转移酶（CGTase）生产环糊精过程中的γ-环糊精（γ-CD）的纯化方法，属于环糊精加工技术领域。

背景技术

环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6~12个D-吡喃葡萄糖单元。其中研究得较多并且具有重要实际意义的是由α-1,4糖苷键连接的6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-环糊精（α-CD）、β-环糊精（β-CD）和γ-环糊精（γ-CD）。

天然的β-CD是目前工业生产中应用的最为广泛的环糊精。目前，β-CD占全球环糊精产量的约70％，α-CD占约15％，而γ-CD仅占约5％，其余约10％的CD产量是各种CD的衍生品。β-CD的价格由于易于分离和纯化而显著降低，而生产α-CD和γ-CD的价格却仍然比较昂贵，这主要是因为α-CD和γ-CD的生产和分离纯化的难度很高。与α-CD和β-CD相比，γ-CD具有更大的疏水腔，更高的水溶性和更有利的生物利用度，使其能够与更大的分子形成不溶性复合物并改善活性物质的溶解度。因此，在食品，化妆品和制药工业中对γ-CD的需求不断增长。然而，由于其低产量和高生产成本，尽管市场需求很大，γ-CD的应用仍然有限。

目前，提高γ-CD产量的方法主要集中在筛选产物特异性更高的γ-CGTase,以及对现有的γ-CGTase进行基因改造以获得更高产量的γ-CD。尽管通过上述手段一定程度提高了γ-CD的所占比例，CGTase作用淀粉的生产产物中仍有较高比例的α-CD、β-CD存在。现阶段，在工业上多是通过“溶剂法”来解决不同CD的分离纯化，即添加有机溶剂作为络合剂，选择性的提取目标CD。如使用1-丁醇可以使α-CD沉淀比例大幅提高。然而，这种溶剂方法也相对昂贵，易燃且有毒。而且，溶剂的高沸点不利于形成的分子的回收。针对以上存在的问题，寻找一种绿色高效的方法来纯化γ-CD是十分重要的。本发明利用对α-CD、β-CD具有高度选择性降解能力，而对γ-CD降解能力较弱的环糊精水解酶来辅助CD生产过程中γ-CD的分离纯化。酶法降解，绿色高效，具有“溶剂法”不可替代的优势。同时，本发明也为环糊精水解酶，这类新兴的多功能淀粉酶拓展了应用面。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种利用环糊精水解酶纯化γ-CD的方法。本发明方法操作简单，绿色环保，通过环糊精水解酶对不同的环糊精的选择性降解能力，来除去α-CD和β-CD，从而提高γ-CD的纯度。

本发明的技术方案，一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其以淀粉糊精为底物，用缓冲溶液配置一定浓度的底物溶液，加入一定量以γ-CD为产物的环糊精葡萄糖基转移酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，灭酶；以上述反应液为底物，向其中加入一定量的环糊精水解酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后灭酶。

进一步的，所述环糊精葡萄糖基转移酶为CGTase，其以γ-CD为产物；具体包括以γ-CD为主产物的γ-CGTase和产物中含有不同比例的γ-CD的α-CGTase，β-CGTase。

进一步的，所述环糊精水解酶在GenBank中的编号为WP_048164969.1。