[发明专利]一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的方法、RPA引物及试剂盒

权利要求书

1.应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA引物，所述引物的序列如下：

上游引物MSRPAF：5'- TCCCTTCTCATGGGCTCATTAAGTCTTAAACCG-3'

下游引物MSRPAR：5'- ACTTTGGTCGTGTAACGGCTAACGCTGGTGTCT-3'。

2.一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA试剂盒，所述试剂盒中的RPA引物的序列如下：

上游引物MSRPAF：5'- TCCCTTCTCATGGGCTCATTAAGTCTTAAACCG-3'

下游引物MSRPAR：5'- ACTTTGGTCGTGTAACGGCTAACGCTGGTGTCT-3'。

3.如权利要求2所述的应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA试剂盒，其特征在于所述试剂盒的反应体系的组成如下：

反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL，RPA冻干酶粉 适量，280mM的醋酸镁溶液2.5μL ，ddH₂O 12.2μL。

4.如权利要求3所述的应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA试剂盒，其特征在于所述试剂盒的反应体系的组成如下：

反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL， 280mM的MgAc溶液2.5μL ，ddH₂O 12.2μL，含有RPA冻干酶粉的RPA反应管，RPA扩增反应在RPA反应管中进行。

5.利用权利要求2~4之一所述的RPA试剂盒来检测杉并根结线虫的方法，其特征在于所述方法为：

提取待测线虫样品的DNA 作为模板，利用杉并根结线虫的RPA试剂盒中的特异性引物作为扩增引物，进行RPA 扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现145 bp的特异DNA 条带，则待测线虫为杉并根结线虫，反之则否。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述RPA扩增的条件如下：38℃反应30分钟。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）提取待测线虫样品的DNA作为模板；

（2）利用杉并根结线虫的RPA试剂盒中的特异性引物作为扩增引物，进行RPA 扩增，RPA扩增的反应体系如下：

反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL，RPA冻干酶粉 适量，280mM的MgAc溶液2.5μL ，ddH₂O 12.2μL；

RPA扩增的条件如下：38℃反应30分钟;

（3）RPA扩增产物进行电泳检测：取出RPA扩增产物5μL，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在145 bp处出现扩增条带的为杉并根结线虫，反之则否。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤（2）的RPA扩增反应按照以下操作进行：在0.2ml 的PCR管中加入反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL，ddH₂O 12.2μL，混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的RPA反应管中混匀，加入280mM的MgAc溶液2.5μL，将RPA反应管置于金属浴中，38℃反应30分钟。