[发明专利]一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的方法、RPA引物及试剂盒

说明书

本发明提供了一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA引物及包含该RPA引物的RPA试剂盒，所述RPA引物的序列如下：上游引物MSRPAF：5'‑TCCCTTCTCATGGGCTCATTAAGTCTTAAACCG‑3'；下游引物MSRPAR：5'‑ACTTTGGTCGTGTAACGGCTAACGCTGGTGTCT‑3'。本发明还提供了利用RPA试剂盒来检测杉并根结线虫的方法，可以检测单个或者混合杉并根结线虫DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好，可以对进境种苗中的杉并根结线虫进行准确鉴定，对于防止根结线虫非中国种的入侵、保护我国农林生产安全具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一套利用重组酶聚合酶等温扩增技术检测杉并根结线虫的引物及方法。

技术背景

根结属线虫(Meloidogyne Goeldi，1887)为植物根系专性内寄生线虫，是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将根结线虫(非中国种)列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。

我国口岸出入境检疫实验室或其他相关部门，都面临着对根结线虫进行快速、准确的鉴定这一难题。近年来，虽然在形态学鉴定的基础上，PCR－RFLP、荧光PCR、特异性PCR、序列测定、LAMP技术等已在线虫鉴定上广泛应用，但多数只能针对南方、花生、爪哇等几种常见的根结线虫进行鉴定。

杉并根结线虫Meloidogyne suginamiensis，这是我国口岸首次截获该种线虫。目前，全球仅日本已报道发现该种线虫，其他国家未有确切报道。该种线虫寄主较广，包括桑树、榆树、樱花、黄瓜、辣椒等20多种木本和草本植物，潜在危害显著，还是日本桑树最重要的病原线虫之一。

随着我国经济发展和生态需求，进境种苗数量快速增长，各种外来生物有可能随之入侵。要防止其入侵，首先必须进行准确鉴定，传统上根结线虫的检测和鉴定主要基于形态学、同工酶技术以及PCR技术，这些技术对操作人员的专业素质要求高，需要高级显微镜、PCR仪等昂贵仪器，且耗时长，难以应用于口岸快速诊断。

重组酶聚合酶等温扩增技术RPA(Recombinase Polymerase Amplifcation)是一项利用重组酶聚合酶等温扩增的技术，该技术可以在37℃至42℃的恒温条件下，利用1对引物在短时间内实现核酸靶标片段的快速扩增，相比另一种环等温扩增扩增技术LAMP，其反应时间更短，反应温度低，且扩增后产生单一目的条带，具有十分广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的方法、RPA引物及试剂盒。

本发明根据通过比对不同根结线虫基因组多拷贝序列和杉并根结线虫基因组中多拷贝序列中特异性位点和非特异性位点进行分析，设计并筛选出一套利用RPA特异性检测爪哇根结线虫的引物，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估(以杉并根结线虫的DNA为模板，苹果根结线虫、山茶根结线虫、爪哇根结线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、西班牙根结线虫、北方根结线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行RPA检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物)，筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

本发明采用的技术方案是：

应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA引物，所述引物的序列如下：

上游引物MSRPAF：5'-TCCCTTCTCATGGGCTCATTAAGTCTTAAACCG-3'

下游引物MSRPAR：5'-ACTTTGGTCGTGTAACGGCTAACGCTGGTGTCT-3'。