[发明专利]杉并根结线虫的PCR检测特异性引物及试剂盒

说明书

本发明提供了一种杉并根结线虫的PCR检测特异性引物及包含该特异性引物的杉并根结线虫的PCR检测试剂盒，所述特异性引物的序列如下：上游引物MSF：5'‑TGGTCGTGTAACGGCTAAC‑3'；下游引物MSR：5'‑GATTTTCGCCCCTCAAACACC‑3'。本发明提供了一种快速、准确利用PCR鉴定杉并根结线虫的方法，应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成检测，灵敏度高，实用性强。

技术领域

本发明属于植物线虫检测鉴定技术领域，具体为杉并根结线虫的PCR检测特异性引物及试剂盒。

背景技术

根结属线虫(Meloidogyne Goeldi，1887)为植物根系专性内寄生线虫，是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将根结线虫(非中国种)列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。

我国口岸出入境检疫实验室或其他相关部门，都面临着对根结线虫进行快速、准确的鉴定这一难题。近年来，虽然在形态学鉴定的基础上，PCR－RFLP、荧光PCR、特异性PCR、序列测定、LAMP技术等已在线虫鉴定上广泛应用，但多数只能针对南方、花生、爪哇等几种常见的根结线虫进行鉴定。

杉并根结线虫Meloidogyne suginamiensis，这是我国口岸首次截获该种线虫。目前，全球仅日本已报道发现该种线虫，其他国家未有确切报道。该种线虫寄主较广，包括桑树、榆树、樱花、黄瓜、辣椒等20多种木本和草本植物，潜在危害显著，还是日本桑树最重要的病原线虫之一。

随着我国经济发展和生态需求，进境种苗数量快速增长，各种外来生物有可能随之入侵。要防止其入侵，首先必须进行准确鉴定，而目前对杉并根结线虫的鉴定仍主要依据传统形态学方法，存在一定的弊端，主要是对鉴定者有较高要求、要求有足够的样本等。因此，发明杉并根结线虫的鉴定方法，可以对进境种苗中的该线虫进行准确鉴定，对于防止根结线虫非中国种入侵、保护我国农林生产安全具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异、准确的杉并根结线虫的PCR检测特异性引物及试剂盒。

本发明系选择参考自行克隆测序获得的杉并根结线虫的核糖体内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer)序列，通过和GenBank中近似种的同源基因进行比对，使用TipMT(http://200.131.37.155/tipMT/？pg＝extract)对特异性位点和非特异性位点进行分析，再使用Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp)设计特异性引物。经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估(以杉并根结线虫的DNA为模板，苹果根结线虫、山茶根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行PCR检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物)，筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

本发明采用的技术方案是：

杉并根结线虫的PCR检测特异性引物，所述特异性引物的序列如下：

上游引物MSF：5'-TGGTCGTGTAACGGCTAAC-3'

下游引物MSR：5'-GATTTTCGCCCCTCAAACACC-3'。

进一步，本发明还提供一种杉并根结线虫的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物的序列如下：

上游引物MSF：5'-TGGTCGTGTAACGGCTAAC-3'

下游引物MSR：5'-GATTTTCGCCCCTCAAACACC-3'。