[发明专利]一种人皮肤成纤维细胞提取方法及其培养基

说明书

本发明公开了一种人皮肤成纤维细胞提取方法，其包括步骤：1)将人的真皮组织剪碎并用含0.25％IV型胶原酶和0.1％胰蛋白酶的混合酶溶液消化至大组织块消失后终止消化；2)过滤消化后的真皮组织，收集滤液，离心，弃上清，收集沉淀的细胞并接种于培养瓶中，用筛选培养基培养；3)培养至细胞融合度达到70％后更换部分筛选培养基为扩增培养基，继续培养；4)培养至细胞融合度达到90％后，传代培养，并更换全部培养基为扩增培养基。其中，筛选培养基的配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8‑12％的澳洲胎牛血清，以及0.4‑0.6ng/mL的EGF和4‑6ng/mL的bFGF作为添加因子；扩增培养基的配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8‑12％的澳洲胎牛血清。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种人皮肤成纤维细胞提取方法及其培养基。

背景技术

成纤维细胞(fibroblast，Fbs)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞功能活动旺盛，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。成纤维细胞的独特性能帮助修复受损皮肤，并降低年龄老化对皮肤的影响。

成纤维细胞合成分泌的胶原纤维是Ⅰ型胶原纤维。处于成熟期或称静止状态的纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。

除创伤修复之外，研究表明，皮肤的厚度和成分会随着年龄增加而改变，老年人的皮肤很容易受伤，且不易愈合，这很可能是因为上层皮肤成纤维细胞缺失所致，成纤维细胞能够刺激这些细胞生长，恢复皮肤的弹性，同样还能刺激毛囊形成，减少疤痕。

人皮肤成纤维培养历史有很多年，但是在原代细胞提取和培养中仍有些技术难点，传统的贴壁法耗时常达30-40天，爬出的细胞融合度过高常出现接触抑制，第一次消化传代后细胞存活率较低，常出现消化后存活细胞状态差等问题；传统的消化法，常常先用胰蛋白酶消化过夜分离真皮层、表皮、脂肪和肌肉等组织，以免消化后杂细胞贴壁存活，造成成纤维细胞纯度降低等问题，在用胶原酶消化4小时左右再过滤出单细胞接种培养，其缺点在于耗时常且过程繁琐，组织块在消化过程中往往先消化下来成纤维细胞后消化下来内皮细胞，消化过度容易造成成纤维细胞受损影响后续培养和传代，消化下来的内皮细胞影响成纤维细胞纯度和生长。

发明内容

针对传统皮肤成纤维细胞提取方法弊端本发明通过采用胰蛋白酶和胶原蛋白酶结合的快速消化法，并使用新配方的筛选培养基去除杂质细胞，快速提取高纯度高活性的人皮肤成纤维细胞(Fbs)。

首先，本发明提供了一种用于人皮肤成纤维细胞提取的皮肤成纤维细胞筛选培养基，其配方为：DMEM高糖培养基作为基础培养基，其中含有体积含量为8-12％的澳洲胎牛血清，以及0.4-0.6ng/mL的EGF和4-6ng/mL的bFGF作为添加因子。

优选地，所述澳洲胎牛血清的体积含量为10％；优选地，EGF的含量为0.5ng/mL，bFGF的含量为5ng/mL。