[发明专利]一种基于循环扩增技术和羧基碳量子点的荧光生物传感器及其制法和应用

说明书

本发明公开了一种基于酶催化靶标循环扩增技术并结合羧基功能化碳量子点的荧光生物传感器及其制法和应用。本发明的技术方案是以肿瘤相关基因miRNA34c为燃料分子，设计了一种由无标记的茎环结构1(HP1)和茎环结构2(HP2)和驱动引物(DP)组成的多轮驱动型DNA纳米机器，从而对痕量靶标进行循环放大。同时，我们合成生物相容性良好的羧基碳量子点(cCQD)首先与荧光探针结合后使得荧光基团淬灭，将由靶标刺激循环扩增过程的S1循环产物加入，室温下放置20min，致使荧光恢复，然后测定混合物的荧光强度，实现对目标物miRNA34c的灵敏检测。该研究思路为实现miRNA34c的灵敏检测提供了新的策略，有望用于肿瘤的早期的诊断中。

技术领域：

本发明涉及一种基于酶催化靶标循环扩增技术并结合羧基功能化的碳量子点荧光探针的生物传感器；本发明还涉及所述生物传感器的制备方法及其检测miRNA的分析应用。

背景技术：

MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码RNA小分子(20～23nt)，通过翻译抑制或通过与目标信使RNA形成RNA诱导沉默复合物(RISC)的靶向降解，miRNAs在多种生物学中的增殖、发育、新陈代谢、免疫反应、肿瘤和病毒感染等生理过程产生着至关重要的影响[Lee I,Ajay S S,Chen H,et al.Nucleic Acids Research,2008,36(5):e27.]。由于miRNA丰度低且易降解，直接检测只能是痕量检测，因此，迫切需要开发灵敏、高选择性、成本效益高和快速的核酸检测系统[Li H,Zhang Y,Wang L,et al.ChemicalCommunications,2011,47(3):961-963.][Qiang W,Li W,Li X,et al.Chemical Science,2014,5(8):3018-3024.][Gresham D,Ruderfer D M,Pratt S C,et al.Science,2006,311(5769):1932-1936.]。

近年来，由于荧光传感器所具有的固有优点，包括操作简单、灵敏度高、成像性能好等[Yuan L,Lin W,Zheng K,et al.Chemical Society Reviews,2013,42(2):622-661.][Yang Y,Zhao Q,Feng W,et al.Chemical Reviews,2012,113(1):192-270.]，在核酸检测方面取得了相当大的进展。值得注意的是，这一类的荧光传感器通常是基于荧光共振能量转移(FRET)或用于检测的淬灭机制[Ray P C,Darbha G K,Ray A,et al.Plasmonics,2007,2(4):173-183.][Li H,Zhang Y,Luo Y,et al.Small,2011,7(11):1562-1568.]，它们通常由一个荧光团和一个位于DNA探针分子相反端的淬灭分子组成。在没有目标存在的情况下，荧光团分子会和淬灭分子接近，荧光被抑制，当与目标分子发生杂交时，淬灭分子与荧光团分子分离距离变远，致使荧光信号被释放出来。然而，尽管荧光传感器在多种应用方面被广泛利用[Holland P M,Abramson R D,Watson R,et al.Proceedings of theNational Academy of Sciences,1991,88(16):7276-7280.][Tyagi,S.；Kramer,F.R.Biotechnol.1996,14,303-308.][Yang C J,Medley C D,Tan W.Currentpharmaceutical biotechnology,2005,6(6):445-452.]，传感器的设计仍然存在缺点，需要挑选荧光团和与之对应的淬灭剂以确保最佳检测效率。近年来纳米材料经常被用作淬灭器，因为它们能够淬灭不同发射波长的各种荧光基团，提高信噪比[Yang R,Tang Z,Yan J,et al.Analytical chemistry,2008,80(19):7408-7413.]。到目前为止，金纳米粒子[Dubertret B,Calame M,Libchaber A J.Nature biotechnology,2001,19(4):365.]，过渡金属双卤代烷[Zhu C,Zeng Z,Li H,et al.Journal of the American ChemicalSociety,2013,135(16):5998-6001.]，碳纳米管[Yang R,Jin J,Chen Y,et al.Journalof the American Chemical Society,2008,130(26):8351-8358.]，氧化石墨烯[Lu C H,Yang H H,Zhu C L,et al.Angewandte Chemie,2009,121(26):4879-4881.]以及金属-有机骨架等[Zhu X,Zheng H,Wei X,et al.Chemical Communications,2013,49(13):1276-1278.]已经被用作高效的纳米淬灭器来开发荧光传感器。虽然这些纳米材料已经成功地作为纳米淬灭剂用于核酸的检测，但其中一些纳米材料的制备往往是复杂而严格的，难以保证其中一些纳米材料具有良好的生物相容性[Liao K H,Lin Y S,Macosko C W,et al.ACSapplied materials&interfaces,2011,3(7):2607-2615.]。因此，需要寻找新的纳米材料作为替代物。