[发明专利]一种胎盘造血干细胞制备方法

权利要求书

1.一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：

（1）胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘

清洗液清洗，备用；

（2）胎盘一次灌洗：取步骤（1）中的胎盘，将胎盘灌洗液A沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；胎盘灌洗液A为勃脉力A，且每L勃脉力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、1-2支肝素钠注射液；

（3）胎盘二次灌洗：取步骤（2）中的胎盘，将灌洗液B沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，静置15-30min，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；灌洗液B为勃脉力A，且每L勃脉力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、1-2支肝素钠注射液、0.01-0.5wt%中性蛋白酶、0.01-0.5wt%Ⅰ型胶原酶；

（4）胎盘三次灌洗：取步骤（3）中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A沿脐动脉注入由脐静脉输出，经过2-5次反复冲洗，收集灌洗后的液体组分；

（5）混合离心：合并步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）所收集的液体组分，

离心，去除上清，向收集的细胞沉淀中加入勃脉力A，得到细胞悬液；

（6）初步纯化：取步骤（5）中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液

混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；

（7）造血干细胞的冻存：取步骤（6）中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液将得到的单个核细胞按1×10⁶个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，置于程序降温冻存盒中于-80℃冻存，24h内转移至液氮罐中冻存；冻存液含有体积分数为10%的 DMSO和体积分数为90%、质量浓度为30-50mg/mL人血清白蛋白的勃脉力A溶液；或者冻存液为含有体积分数84%、质量浓度为30-50mg/mL人血清白蛋白的勃脉力A溶液、体积分数为10%的DMSO和体积分数为6%、质量浓度为15-30g/L羟乙基淀粉的勃脉力A溶液。

2.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于：步骤（1）中的胎盘清洗液为pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，其中每L磷酸盐缓冲液中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、100-500mg/L庆大霉素、50-200mg/L两性霉素B。