[发明专利]一种胎盘造血干细胞制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘造血干细胞制备方法，包括以下步骤：(1)胎盘预处理；(2)胎盘一次灌洗；(3)胎盘二次灌洗；(4)胎盘三次灌洗；(5)混合离心；(6)胎盘初步纯化；(7)造血干细胞的冻存；该制备方法可提高CD34阳性细胞的分离数量、细胞活力，而且所采用的试剂均无潜在风险，可应用于临床，并降低了实验成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘造血干细胞制备方法。

背景技术

造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSCs)是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力，即可以通过一个细胞周期后产生两个与分裂前具有相同性质的细胞，以及具有在一定外界条件下分化成各类成熟血细胞的潜能。

造血干细胞最先发生染色体易位等主要的致病突变，这种突变并不影响其分化能力，即可分化为具有正常功能的成熟血细胞，当已发生染色体易位的造血干细胞或者由发生了染色体易位的造血干细胞分化的成熟血细胞发生第二次突变，就会引发白血病，如急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)和慢性髓细胞白血病(chronicmyelocytic leukemia，CML)的发生都与造血干细胞异常存在直接或间接的关系。造血干细胞在实体肿瘤微环境调节中也具有一定作用，如前列腺肿瘤细胞会模拟造血干细胞的分子信号，进入造血微环境，并引起造血干细胞表达谱的改变迫使造血干细胞离开，也可以通过表达造血细胞迁移相关的分子离开造血微环境，最终导致肿瘤的转移。

随着对造血干细胞研究的深入，在临床治疗中，造血干细胞移植广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病等血液系统疾病，某些实体瘤以及自身免疫疾病等。通常，造血干细胞根据来源不同可分为三种，即骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞以及脐血造血干细胞。随着造血干细胞领域的研究进展，发现成熟的胎盘中存在大量的造血干细胞，相比于传统三种来源的造血干细胞，胎盘来源的造血干细胞不但免疫原性低、在数量上具备绝对优势，而且是相对更为原始的祖细胞，除此之外，胎盘为产妇生产后的废弃物，具有来源丰富，且采集过程不会对母体或新生儿造成损伤的优点。

目前，现有的从胎盘提取造血干细胞的流程为：(1)将胎盘或胎盘小叶用机械法分解剪碎；(2)采用一种酶或多种酶联合分步骤消化；(3)取消化液用羟乙基淀粉法或淋巴细胞分离法分离出消化液中含有造血干细胞的单个核细胞；(4)分离出的单个核细胞用免疫磁珠法或流式细胞仪等方法富集。但是以上所述现有技术存在以下缺点：(1)分离过程长、操作步骤繁琐，容易丢失细胞的同时，极易造成细胞污染；(2)胎盘体积较大，消化过程需大量酶，且不易控制消化过程进度，容易造成过度消化，因细胞损伤而失活，并且酶的大量使用必然增加实验成本。

另外，目前所用的造血干细胞冻存方法中所使用的冻存液添加了胎牛血清或供体自身的血清，血清含有大量未知成份，且质量不易控制，存在一定安全隐患，对后期临床应用造成一定困扰。

发明内容

本发明的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种胎盘造血干细胞制备方法，该制备方法可提高CD34阳性细胞的分离数量、细胞活力，而且所采用的试剂均无潜在风险，可应用于临床，并降低了实验成本。

为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：

一种胎盘造血干细胞制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液清洗，备用；

(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；

(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将灌洗液B沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，静置15-30min，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；