[发明专利]一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用。本发明类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用大肠杆菌表达系统，可高效可溶性表达该类芽孢杆菌甲壳素酶。然后利用离子液体对蟹壳粉进行预处理，以纯化后的类芽孢杆菌甲壳素酶为催化剂，同未处理的蟹壳粉相比，处理后的蟹壳粉的酶解效率提高了三倍。因此，本发明类芽孢杆菌甲壳素酶及其在酶解离子液体预处理后蟹壳粉中的应用，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用。

背景技术

甲壳素酶（Chitinase, EC.3.2.1.12）是一类可水解甲壳素中β-1,4糖苷键的水解酶，主要存在于细菌、真菌及植物中。根据其结构特征，可分为糖苷水解酶（Glycosidehydrolase, GH）18和19两个家族，大部分细菌来源的甲壳素酶属于GH18家族，而GH19家族甲壳素酶主要为植物来源。甲壳寡糖是甲壳素经甲壳素酶水解得到的低聚糖，在医药、食品保健和植物防御等方面的应用已经被发掘，并已成为甲壳素研究的一个热点。在工业上，常用化学法（强酸、强碱）和物理法对甲壳素类生物大分子进行水解以制备甲壳低聚糖，但这两种方法制备的壳寡糖产品性质不稳定、降解条件难以控制，且化学法对环境污染较严重。酶法转化甲壳素为下游壳聚糖及壳寡糖类产品，是降低传统化学法对环境造成污染的一个有效的解决途径。蛋白酶及纤维素酶等非特异性酶的使用，虽然能在一定程度上缓解以上状况，但专一性的不足限制了此类酶制剂的使用。因此，研发高活性的甲壳素酶对壳寡糖类产品的工业生产具有重要意义。

本发明研究人员前期从含甲壳素土壤中筛选出一株产甲壳素酶菌株，通过对其发酵培养基进行优化，使其甲壳素酶产量有了一定的提高。通过对其全基因组进行测序及分析，发现该菌株有多种甲壳素酶基因。因此，为获得高活性的甲壳素酶，我们选择选取其中一种甲壳素基因进行克隆并在大肠杆菌中进行表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用，旨在提供一种经济高效的甲壳素酶，并将其应用于经离子液体预处理的蟹壳粉末的降解中，具有很好的工业化应前景。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下。

一种类芽孢杆菌甲壳素酶，所述类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2 所示。

优选的，编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

以上所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶的制备方法，该方法包括以下步骤：

将核酸序列如SEQ ID NO.1 所示的甲壳素酶基因与表达载体连接，构建重组载体，然后将重组载体转入表达菌株中，诱导并获得可胞内可溶性表达的类芽孢杆菌甲壳素酶。

优选的，所述甲壳素酶基因(PpChi1)来源于类芽孢杆菌菌株CS0611(分类命名为Paenibacillus pasadenensis CS0611，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014458，保藏日期为 2014年10月8日)，为本实验室筛选得到，其全基因组测序由深圳华大基因完成。通过Illumina Hiseq2500平台测序，样品共产出1,255Mb数据。基因组组分分析后发现，样品paenibacillus的基因组含有5,468个基因，总长度为4,848,621 bp，平均长度887bp，占基因组全长的85.63％。串联重复序列共964个，总长为73,335bp，占基因组全长的1.2952％。小卫星序列701个，微卫星序列52个，tRNA 22个，rRNA 0个。

优选的，所述表达载体为pET-22b、pET-28a及pET-30a中的一种。

优选的，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。