[发明专利]一种鸭原代肝细胞分离及培养方法在审
| 申请号： | 201811315762.5 | 申请日： | 2018-11-07 |
| 公开（公告）号： | CN109321516A | 公开（公告）日： | 2019-02-12 |
| 发明（设计）人： | 吴磊;覃媛钰;张依裕;罗华伦 | 申请（专利权）人： | 贵州大学 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 贵阳中新专利商标事务所 52100 | 代理人： | 张行超 |
| 地址： | 550025 贵州省贵*** | 国省代码： | 贵州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 原代肝细胞 吹打 悬浮细胞 肝组织 离心管 混匀 清洗 冰水混合物 肝细胞悬液 完全培养基 血清培养基 消化 生长状态 附属物 培养基 消化液 血清 冰浴 剪碎 去除 水浴 肝脏 过滤 重复 | ||
1.一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)在无菌条件下取出胚胎，放入盛有PBS缓冲液的无菌平皿中清洗至无血迹为止；
(2)剖开腹部取出肝脏，置于PBS缓冲液中轻轻清洗，以去除肝组织上的其他附属物；
(3)将清洗干净的肝组织剪碎，之后将其转移至10ml离心管中，吹打混匀，3000r.min-1离心5min；
(4)弃上清，用3～4倍体积的消化液悬浮细胞，37℃水浴消化10min，每隔5min吹打混匀；
(5)加入3倍体积含有血清的培养基终止消化，200目细胞筛过滤，上清转移至10mL无酶离心管中，1000r·min-1离心5min；
(6)弃上清，血清培养基悬浮细胞，冰水混合物中冰浴8～12min，1000r·min-1离心5min，重复此步骤一次；
(7)加DMEM完全培养基，形成肝细胞悬液，轻轻吹打均匀即可。用血细胞计数板计数肝细胞量，0.4％台盼蓝染色试验判断肝细胞存活率。
2.根据权利要求1所述的鸭原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于：步骤(1)和(2)中PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的鸭原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于：步骤(3)中肝组织剪碎至0.5～1mm3，离心温度为4℃。
4.根据权利要求1所述的鸭原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于：所述步骤(7)中DMEM完全培养基含有10％的胎牛血清、100u/mL青霉素和100u/mL链霉素的双抗、6ug/mL胰岛素H-DMEM培养基。
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