[发明专利]一种鸭原代肝细胞分离及培养方法

说明书

本发明公开了一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：将鸭肝脏置于PBS缓冲液中轻轻清洗，以去除肝组织上的其他附属物；将清洗干净的肝组织剪碎，之后将其转移至10ml离心管中，吹打混匀，离心；(4)弃上清，用3～4倍体积的消化液悬浮细胞，37℃水浴消化10min，每隔5min吹打混匀；(5)加入3倍体积含有血清的培养基终止消化，过滤，上清转移至离心管中，离心；(6)弃上清，血清培养基悬浮细胞，冰水混合物中冰浴，离心，重复此步骤一次；(7)加DMEM完全培养基，形成肝细胞悬液，轻轻吹打均匀即可。本发明提供了一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的鸭原代肝细胞的方法。

技术领域

本发明涉及一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，属于细胞技术领域。

背景技术

鸭肝是鸭储存养料和解毒的重要器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用。鸭的许多疾病都侵害肝脏，比如鸭病毒性肝炎、大肠杆菌病、沙门氏菌病等等，因此鸭的原代肝细胞分离培养尤为重要。但是，在一般培养条件下，原代肝细胞在体外培养的时间短，分化功能维持时间短，特异性功能迅速降低，限制了肝细胞的应用。

自1953年Anderson首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来，各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进，在众多方法中，主要分为非灌流的方法和灌流的方法。非灌流的方法主要有机械分离法、胰酶消化法、胶原酶消化法等；非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用，但存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块等问题。1969年，Berry和Friend引入了肝脏灌流法，灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触，不仅提高了分离效率，还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高。灌流的方法主要有离体胶原酶灌流法、原位胶原酶灌注法、半原位胶原酶灌注法等等。然而，尽管两步灌流法在实际应用中也经过了无数次改良，但始终没有摆脱采用胶原酶进行灌注的观念。现有胶原酶灌注法有插管易失败，成本高(胶原酶用量大)，提取肝细胞的纯度和成活率不高等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，以解决现有技术存在操作复杂、成本高、提取细胞成活率和纯度低等问题。

本发明的技术方案是：一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：

(1)在无菌条件下取出胚胎，放入盛有PBS缓冲液的无菌平皿中清洗至无血迹为止；

(2)剖开腹部取出肝脏，置于PBS缓冲液中轻轻清洗，以去除肝组织上的其他附属物；

(3)将清洗干净的肝组织剪碎，之后将其转移至10ml离心管中，吹打混匀，3000r.min^-1离心5min；

(4)弃上清，用3～4倍体积的消化液悬浮细胞，37℃水浴消化10min，每隔5min吹打混匀；

(5)加入3倍体积含有血清的培养基终止消化，200目细胞筛过滤，上清转移至10mL无酶离心管中，1000r·min^-1离心5min；

(6)弃上清，血清培养基悬浮细胞，冰水混合物中冰浴8～12min，1000r·min^-1离心5min，重复此步骤一次；

(7)加DMEM完全培养基，形成肝细胞悬液，轻轻吹打均匀即可。用血细胞计数板计数肝细胞量，0.4％台盼蓝染色试验判断肝细胞存活率

步骤(1)和(2)中PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。

步骤(3)中肝组织剪碎至0.5～1mm³，离心温度为4℃。

所述步骤(7)中DMEM完全培养基含有10％的胎牛血清、100u/mL青霉素和100u/mL链霉素的双抗、6ug/mL胰岛素H-DMEM培养基。