[发明专利]用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用在审
| 申请号： | 201811320658.5 | 申请日： | 2018-11-07 |
| 公开（公告）号： | CN109371167A | 公开（公告）日： | 2019-02-22 |
| 发明（设计）人： | 鲁文静;兰峰;张治宇 | 申请（专利权）人： | 北京赛贝生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6897 | 分类号： | C12Q1/6897;C12N15/90;C12N15/85;C12N15/10;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京康信知识产权代理有限责任公司 11240 | 代理人： | 韩建伟;金田蕴 |
| 地址： | 100220 北京市昌平区*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因 报告基因 基因元件 移码突变 编辑系统 切割 检测 沉默子 启动子 高稳定性 核心元件 切割目标 切割效率 荧光表现 有效连接 活细胞 基因组 可插入 荧光表 终止子 应用 | ||
1.一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件，其特征在于，所述基因元件包括有效连接的启动子、第一报告基因、REST基因、SV40pA基因、S沉默子、第二报告基因和终止子，其中，所述启动子与第一报告基因基因之间可插入被切割目标DNA序列，所述第一报告基因不同于所述第二报告基因，所述REST基因的表达能够抑制所述S沉默子后面第二报告基因的表达。
2.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述基因元件还包括有效连接的增强子。
3.根据权利要求2所述的基因元件，其特征在于，所述增强子为CMV增强子。
4.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述第一报告基因为红色荧光蛋白基因，所述第二报告基因为绿色荧光蛋白基因。
5.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述启动子为EF1启动子，所述终止子为β-球蛋白聚腺苷酸。
6.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述基因元件含有双酶切位点，所述双酶切位点位于所述启动子和所述第一报告之间，所述被切割目标DNA序列可连接至所述双酶切位点之间。
7.根据权利要求6所述的基因元件，其特征在于，所述双酶切位点为Xba I和Kpn I酶切位点。
8.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述REST基因和所述S沉默子扩增于人源H9细胞系。
9.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述基因元件具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
10.一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求1至9中任一项所述的基因元件。
11.根据权利要求10所述的载体，其特征在于，所述载体为pUC系列载体、pEASY、pBlueScriptII或pBR322。
12.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求10或11所述的用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的载体。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
14.一种检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的方法，其特征在于，采用如权利要求10或11所述的用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的载体进行检测。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将如权利要求10或11所述的载体插入被切割目标DNA序列，然后转染至细胞系中，同时转入装载有gRNA的载体，所述装载有gRNA的载体还包含表达Cas9蛋白的DNA序列；
S2，观察第一报告基因和第二报告基因的表达情况，根据所述第一报告基因和第二报告基因的表达情况判断gRNA对目标DNA序列的编辑是否产生了移码突变。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，还包括：当所述第二报告基因正常表达时，判断为CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生了移码突变，并扩增所述目标DNA序列进行测序。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞系为HEK293细胞系。
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