[发明专利]用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用。该基因元件包括有效连接的启动子、第一报告基因、REST基因、SV40pA基因、S沉默子、第二报告基因和终止子，其中，启动子与第一报告基因基因之间可插入被切割目标DNA序列，第一报告基因不同于第二报告基因，REST基因的表达能够抑制S沉默子后面第二报告基因的表达。用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件可作为核心元件连接到载体中，可以用来在活细胞胞内鉴定gRNA对基因组的切割效率，该检测具有产生移码突变时是即时荧光表现型、高稳定性的荧光表型和易操作性。

技术领域

本发明涉及基因工程中的克隆技术和分子检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用。

背景技术

规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR)是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式。2012年，Jinek等使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对基因组DNA进行操作，并证实了这一系统可以在活体细胞实现RNA介导的基因编辑。至今，CRISPR/Cas9基因编辑系统广泛应用于目的基因编辑。特别是在诱导性多功能干细胞(Induced Pluripotent Stem cells，iPS cells)或胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESCs)中的应用，使用CRISPR/Cas9基因编辑系统修改基因组所获的细胞系可以模仿基因病患者，用于目的新药、特效药的研发；或失活特定突变的基因，达到基因编辑治疗疾病的目的。另一方面，由于CRISPR/Cas9基因编辑系统是RNA介导的，所以gRNA是否具有专一的切割位点是最核心的，制约CRISPR/Cas9基因编辑系统使用的因素，是决定前述目的实现的关键要素之一。因此，gRNA设计好坏决定目标基因组被切割的效率；专一性的gRNA可以减少脱靶几率，提高基因编辑的正确率，避免额外错误的编辑。所以，需要一种检测方法来快速鉴定所设计的gRNA对基因组的切割效率和编辑产生移码突变后的基因组碱基序列是怎样分布的。

发明内容

本发明旨在提供一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用，以提供一种快速的、可在活细胞胞内鉴定gRNA对基因组的切割效率的方法。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件(CRISPR/Cas9Indel Assay system,CIAs)。CIAs基因元件包括有效连接的启动子、第一报告基因、REST基因、SV40pA基因、S沉默子、第二报告基因和终止子，其中，启动子与第一报告基因基因之间可插入被切割目标DNA序列，第一报告基因不同于第二报告基因，REST基因的表达能够抑制沉默子后面第二报告基因的表达。

进一步地，基因元件还包括有效连接的增强子。

进一步地，增强子为CMV增强子。

进一步地，第一报告基因为红色荧光蛋白基因，第二报告基因为绿色荧光蛋白基因。

进一步地，启动子为EF1启动子，终止子为β-球蛋白聚腺苷酸。

进一步地，基因元件含有双酶切位点，双酶切位点位于启动子和第一报告之间，被切割目标DNA序列连接至双酶切位点之间。

进一步地，双酶切位点为Xba I和Kpn I酶切位点。

进一步地，REST基因和S沉默子扩增于人源H9细胞系。

进一步地，基因元件具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。