[发明专利]过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体，通过以下方法制备得到：使用无血清培养基培养原代神经干细胞至2代或以后，采用过表达pEGFP‑N1质粒转染使原代神经干细胞过表达circScmh1，然后收集细胞上清，依次离心去除漂浮细胞、死细胞、细胞碎片，再次离心收集沉淀，重悬，离心重悬液，收集沉淀得到过表达circschm1的神经干细胞外泌体。本发明提供的过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体能够高效靶向脑卒中梗死侧皮层部位，显著减少脑缺血诱发的脑梗死范围，提高神经功能学评分，有望开发为治疗缺血性脑卒中疾病的潜在药物。

技术领域

本发明属于医药技术，具体涉及一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体及其制备方法与应用。

背景技术

脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，是目前全球第二大致死性疾病，具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”的特点，其病因主要是各种因素引起脑内动脉狭窄、闭塞或破裂，从而导致急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性神经功能障碍的症状和体征。脑卒中主要包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中发病率约占脑卒中病人总数的60％～70％，控制脑卒中病死率并提高生存质量是当前医学研究函待解决的难题。

目前临床常用治疗策略首选以溶栓为主，迅速复流再通是缺血性脑卒中急性期治疗成功的前提，但是在临床应用中存在着诱发脑出血等并发症以及溶栓治疗的时间窗的限制。实验动物研究发现，由缺血缺氧诱导的一系列瀑布样延迟性生化级联反应是导致脑卒中组织损伤及长期行为学障碍的关键原因。缺血性脑损伤涉及非常复杂的病理生理过程，目前研究揭示的影响脑卒中发生、发展的主要病理机制包括兴奋性毒性损伤、能量代谢障碍、离子稳态失衡、神经元过度去极化、氧化应激、炎症反应、血脑屏障破坏、凋亡和再生障碍等。基于该疾病的病理特点，深入研究脑卒中神经损伤及神经保护机制，寻找具有神经保护作用的药物具有非常重要的意义。

环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，以非经典剪接方式进行反向剪接而形成，是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴并以共价键形成环形结构的RNA分子。在对circRNA结构和功能的研究基础上，已知circRNA参与调节多种生理和病理过程，在疾病的发生发展中起着重要的作用，如神经紊乱、阿尔兹海默症、动脉粥样硬化。

前期通过大数据筛选得到circScmh1，研究表明脑卒中患者血浆circScmh1水平明显下调，上调脑内circScmh1水平可能具有具有减少脑卒中梗死面积，提高神经评分的作用。但目前仍缺少合适的载体可以高效的将circ schm1载入脑缺血梗死部位。

发明内容

发明目的：针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体及其制备方式，还提供了其具体应用。

技术方案：本发明所述的一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体，其通过以下方法制备得到：使用无血清培养基培养原代神经干细胞至2代或以后，采用过表达pEGFP-N1质粒转染使原代神经干细胞过表达circScmh1，然后收集细胞上清，依次离心去除漂浮细胞、死细胞、细胞碎片，再次离心收集沉淀，重悬，离心重悬液，收集沉淀得到过表达circ schm1的神经干细胞外泌体。

其中，所述无血清培养基为DMEM/F-12(GIBCO,11330032)和B27minus vitamin A(GIBCO,12587010)。

所述pEGFP-N1质粒转染浓度为每1*10^5-1*10^6个神经干细胞，加入1-10ugpEGFP-N1质粒转染，转染12-72小时。

所述重悬采用PBS溶液。

本发明制备所得过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体为粒径40-100nm的盘状囊泡状结构，circScmh1较对照外泌体过表达8-10倍。