[发明专利]一种表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒载体疫苗株

说明书

本发明的目的是提供一种表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒载体疫苗株，通过对H9N2病毒HA蛋白的编码基因进行序列优化，解决了表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的重组毒表达效率较低，诱导的抗体水平不高，免疫原性不理想的问题。制备的弱毒株免疫动物后均可以对当前流行的基因VII新城疫病毒提供良好的保护作用，同时可以提供对H9N2禽流感病毒侵害的防控。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒载体疫苗株。

技术背景

世界动物卫生组织(OIE)规定的A类传染病中，高致病性禽流感(HPAI)和新城疫(ND)是其中的2种禽类烈性传染病。高致病性禽流感由H5或H7亚型禽流感病毒(AIV)引起，可导致感染禽群100％的死亡，每年给养殖业造成巨大的经济损失，尤其是近年流行的H7N9AIV，再次引起大家对禽流感的恐慌。H9亚型AIV属于低致病性禽流感病毒，感染鸡群的直接致死率不高，但传播迅速，可造成禽群的免疫抑制并继发其它疾病。新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的急性传染病，目前已在世界范围内发生了4次大流行，每次流行造成的损失难以估计。流行病学调查显示，当前流行的新城疫病毒主要是基因Ⅶ型。

疫苗接种是预防禽流感和新城疫最有效的措施，但弱毒苗和灭活苗的免疫接种在临床上会干扰对这2种疾病的检测和流行病学调查，2种疫苗同时免疫还会增加家禽的免疫压力，且生产成本较高。虽然基因工程疫苗能够解决上述的问题，但与生产要求相比，还有一定的差距。因此获得免疫原性更好、诱导抗体效价更高、与流行毒株更匹配的重组毒株是目前生产急需解决的问题。但现有技术构建的表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的重组毒表达效率较低，诱导的抗体水平不高，免疫原性不理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒载体疫苗株，通过反向遗传技术获得表达禽流感病毒AIV H9N2蛋白的重组NDV毒株作为疫苗的侯选株。

本发明首先提供一种表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒株,所述的病毒株的制备方法如下：

1)构建新城疫病毒NDV全基因组转录质粒，所述的转录质粒，其中将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的H9N2的HA蛋白编码基因插入到新城疫病毒株NDV基因组的P基因与M基因之间；

所述的将HA蛋白编码基因插入到新城疫病毒株NDV基因组的P基因与M基因之间，其一种方法是在新城疫病毒株NDV基因组的第3171nt之后引入Pme I酶切位点，再将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的H9N2HA蛋白编构建码基因插入到酶切位点处；

2)构建用于表达新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的辅助重组质粒；

3)将构建的新城疫病毒NDV全基因组转录质粒和3个辅助重组质粒共转染表达T7RNA聚合酶的细胞系DF1-T7，培养获得表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒株。

本发明再一个方面提供一种表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒株，是用上述方法构建的；

所获得的表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒株用于制备疫苗。

本发明另一个方面提供一种重组疫苗，其中使用的抗原为上述的表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒株。

本发明通过对H9N2病毒HA蛋白的编码基因进行序列优化，解决了表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的重组毒表达效率较低，诱导的抗体水平不高，免疫原性不理想的问题。制备的弱毒株免疫动物后均可以对当前流行的基因VII新城疫病毒提供良好的保护作用，同时可以提供对H9N2禽流感病毒侵害的防控。

附图说明

图1：NDV基因组中Pme I酶切位点的引入图；

图2：HA基因的PCR鉴定电泳图；