[发明专利]一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明对来源于Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶的234位的甲硫氨酸进行定点突变，M234I、M234A、M234L和M234V突变体对麦芽糖的受体亲和力均比野生型提高了45.6％、34.7％、30.3％和36.9％，本发明的环糊精葡萄糖基转移酶突变体能够应用于海藻糖制备中，使海藻糖的转化率得到进一步的提高。

技术领域

本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，尤其是一种在歧化反应中对麦芽糖的受体亲和力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)由两个吡喃葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，是一种稳定的非还原性二糖，同时具有独特的高保湿性，高度安全性和有良好的稳定性，被广泛应用于医药、食品、化妆和农业等领域。

自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖对生理功能作用的研究，现已成为国际上开发研究的主要低聚糖之一。

海藻糖的合成主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。其中，以玉米淀粉为底物，使用双酶法生产海藻糖转化率高达80％以上，其作用机理为以淀粉为底物经普鲁兰酶脱支为麦芽糊精、麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α-1,4-糖苷建，通过分子内转糖苷作用将α,α-1,1-糖苷键转为α,α-1,1-糖苷键，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,1- 糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。双酶法生产海藻糖以淀粉为底物，具有低成本的优点。但是麦芽寡糖基海藻糖合成酶对麦芽四糖和麦芽三糖的亲和性较低，导致反应液中的小分子麦芽寡糖难以利用，使得在工业生产中淀粉底物的利用率降低，尤其是当使用大米淀粉为底物时，体系中的无法被利用的小分子糖较玉米淀粉更多，这无形之中提高了生产成本。

环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransfer，CGT酶，EC2.4.1.19)是一种胞外酶，同时也是一种多功能酶，能催化三种转糖基反应(歧化、环化和耦合反应)和一种水解反应。有研究表明，在多酶体系复配生产海藻糖的酶反应中，CGTase的存在可以将小分子糖的糖链接长，进而使之更容易被利用于合成海藻糖，该复配方法提高了底物利用率。而分析酶转化结果发现，反应结束后，体系中仍存在较多的麦芽糖，因此使用一种在歧化反应中对麦芽糖受体的亲和性高的CGTase能够有助于利用这一部分麦芽糖。目前国内外文献中关于 CGTase对麦芽糖受体的亲和性的报道较少，仅Bacillus circulans和Paenibacillus sp.有相关报道，其中Bacillus circulans来源的CGTase对麦芽糖的受体亲和性远高于Paenibacillus sp.。若能进一步提升Bacillus circulans CGTase对麦芽糖为受体的亲和性，进一步利用体系中的麦芽糖，就可以进一步提高底物利用率，从而继续降低成本，这对海藻糖的双酶法生产具有重要意义。

发明内容

基于上述现状，本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高环糊精葡萄糖基转移酶在歧化反应中对麦芽糖的受体亲和力，进一步提高底物利用率，从而提高海藻糖的产量。

本发明的第一个目的是提供了具有酶活提高的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，包含了将来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶的第234位的氨基酸进行取代得到的突变体。这些突变体与其亲代的环糊精葡萄糖基转移酶相比，歧化反应中对麦芽糖的受体亲和力提高。

在本发明的一种实施方式中，所述环状芽孢杆菌(B.circulans)。