[发明专利]一种表达制备乳二糖磷酸化酶的方法

说明书

本发明涉及一种高效表达制备乳二糖磷酸化酶的方法，是将乳二糖磷酸化酶LNBP基因与枯草芽孢杆菌用载体构建重组表达载体。然后将重组表达载体转化至枯草芽孢杆菌中构建重组工程菌。将重组工程菌在液体培养基中诱导培养，菌液离心，取上清液。本发明的方法乳二糖磷酸化酶产量高，蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单，为LNBP的工业化大规模生产提供了便利，提高了产量，省时省力，节约成本。尤其是对该酶在食品工业中的应用提供了安全保障，具有重大意义。

技术领域

本发明涉及一种能高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌以及用改进高效表达制备乳二糖磷酸化酶的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

LNBP(EC2.4.1.211,lacto-N-biose phosphorylase,LNBP)是一种可逆的磷酸化酶，可以催化LNB和GNB(galacto-N-biose)产生N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和β-D-半乳糖1-磷酸(Gal 1-P)。证实双歧杆菌中具有编码代谢LNB的基因簇，其中LNB通过特定的ABC型转运蛋白转运至细胞质，通过LNBP并最终在糖酵解和氨基糖代谢途径中被代谢。双歧杆菌是婴幼儿肠道中重要的优势菌，也是人体肠道内最主要的有益菌之一，对维持婴幼儿健康发育有着极其重要的作用。乳二糖(lacto-N-biose，LNB)是母乳中寡糖的重要组成部分，也是双歧杆菌维持生命活动的重要底物，对促进双歧杆菌在婴幼儿肠道中的定植与增殖具有重要的作用。双歧杆菌可以通过乳二糖磷酸化酶来代谢LNB获得生命活性所需要的能量。此外，枯草芽孢杆菌被认为是动物肠道内的益生菌，安全性高，可应用于食品、药品等工业中，具有非致病性；外源DNA获取方便，不仅质粒可作为异源基因的克隆载体，噬菌体也可以应用于此，具有较强的遗传特性；蛋白的分泌系统较为完善，分泌的外源蛋白可跨过细胞膜直接释放到细胞外，具有较强的蛋白分泌能力，从而简化蛋白的回收和纯化过程，适用于工业化生产；在较为简单的培养基中培养，就能达到很高的菌密度，适用于工业化生产。然而现有技术中，乳二糖磷酸化酶在野生菌中提取时的产率很低，分离精制困难，不适合大批量的制备。有通过大肠杆菌表达乳二糖磷酸化酶的，但在大肠杆菌中是胞内表达，易形成包涵体，同时，酶蛋白的获取需要对细胞进行破碎处理，杂蛋白含量高，分离精制困难，操作繁琐耗时，蛋白表达量也不高。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的之一是采用基因工程技术构建一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体及重组工程菌。

本发明的目的之二是提供一种产量高，蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单的利用重组工程菌生产乳二糖磷酸化酶的方法。

本发明采用的技术方案是：一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的重组表达载体是将乳二糖磷酸化酶(LNBP)基因与表达载体连接，构建的重组表达载体；所述的表达载体是枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体。

进一步的，上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的表达载体是pHT系列载体、穿梭载体pMA5或穿梭载体pWB980等。但不限于这些载体，所有枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体均可使用。

更进一步的，上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的pHT系列载体是pHT43、pHT304或pHT01载体。

进一步的，上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的表达载体中含有或不含有蛋白纯化标签。

更进一步的，上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的蛋白纯化标签是组氨酸(His-tag)标签。

一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌，是将上述的高效表达乳二糖磷酸化酶的重组表达载体转化至宿主菌中构建的重组工程菌；所述的宿主菌是枯草芽孢杆菌。

进一步的，上述的一种高效表达乳二糖磷酸化酶的重组工程菌，所述的转化为电转化。