[发明专利]一种海洋环境来源的几丁质酶及其基因

说明书

本发明提供一种海洋环境来源的几丁质酶及其基因，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，所述几丁质酶基因核苷酸序列的如SEQ ID NO.1所示；几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；含所述基因的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒；含所述基因的细胞由所述载体转化而得；所述几丁质酶的基因的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海洋环境来源的几丁质酶及其基因。

技术背景

基于宏基因组学研究样品微生物的发展使我们能够解锁很多功能多样性，从而获得新的基因和有用的生物分子。几丁质编码基因资源非常丰富，但是99%的微生物都是不可培养的，给获取几丁质基因带来了巨大的困难。采用宏基因组法可以绕过微生物的培养环节直接研究所有微生物的基因信息。2014年，Karin Hjort等人使用土壤宏基因组构建的文库，针对未培养的细菌群落的几丁质酶，发现了一种新型的细菌几丁质酶Chi18H8，Chi18H8是从宏基因组文库中得到的第一个纯化酶，并具有作为控制植物真菌病害制剂的潜力。2015年，Mariana Silvia Cretoiu等人从土壤的宏基因组文库筛选编码新型几丁质分解酶的基因，成功扩增了5条完整的几丁质酶基因，克隆并表达了一种耐盐性几丁质酶。2017年，Thimoteo 等人通过使用含有胶体几丁质的平板对使用大肠杆菌构建的宏基因组库进行基于功能的筛选，从废水污染的土壤中鉴定出一种几丁质酶。2015年Yuchun Liu等人利用genomic walking技术从猪粪的宏基因组获得了一种新的外切几丁质酶基因。

根据几丁质酶的作用方式分类，分为几丁质内切酶、几丁质外切酶和N-乙酰基葡糖苷酶。几丁质内切酶随机切割几丁质的β-1,4-糖苷键，产生几丁二糖和可溶的的低分子量的不同聚合度的几丁寡糖，外切几丁质酶从还原和非还原端切割链以形成几丁二糖（GlcNAc₂），N-乙酰基葡糖苷酶将GlcNAc₂水解成GlcNAc或从N-乙酰-寡糖的非还原端产生N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GLcNAc）单体。

根据氨基酸序列同源性，几丁质酶分属于18、19和20家族葡萄糖苷水解酶。18家族包括来自病毒、细菌、真菌、动物和某些植物几丁质酶的几丁质酶。19家族包含一些植物几丁质酶和链霉菌几丁质酶。家族18和19不具有氨基酸序列的相似性，它们具有完全不同的3D结构，因此据说是从不同的祖先进化而来。家族20涉及来自细菌、某些真菌和人类的N-乙酰氨基葡糖苷酶。序列同源性的分析已经将18家族几丁质酶分成亚科A，B和C，迄今为止，亚家族B和C几丁质酶仅在少数细菌中被鉴定出来，而亚家族A几乎遍及陆地和水生栖息地，后者包括分子量为20-115KDa，最适温度18-90℃，pH值2.0-10.5，等电点为3.5-8.0的蛋白质。

现有在医学、农业和工业上有用的酶和天然产物，主要来源于容易培养的微生物。然而，在标准的实验室条件下，绝大多数环境中的微生物是不可培养的。宏基因组文库的表达筛选可获得不可培养的微生物群的功能多样性以及发现对生物技术应用有用的新型酶。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种海洋环境样品宏基因组来源的几丁质酶及其基因，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中中克隆表达的方法，提供具有潜在应用价值的新酶源。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

本发明的几丁质酶，所述几丁质酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有几丁质酶基因的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒；所述的载体为pET28a(+)-Chitinase或pPIC9k-Chitinase。

含有几丁质酶的基因的细胞选大肠杆菌细胞或酵母细胞；所述细胞由所述载体转化而得；所述细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。