[发明专利]一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法

权利要求书

1.一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)改性磷脂的制备

S1：将磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为3-5％的磷脂溶液；

S2：将所述磷脂溶液在惰性气体氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；所述电磁-超声耦合处理的方法为：电磁场处理的强度为2500-4000高斯，压力为0.1-0.2bar，超声波频率为30KHz，处理温度为25℃，处理时间为8-10min；

(2)改性磷脂微粒的制备

S1：向所述改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25-26℃；

S2：在惰性气体氛围保护下进行超声波震荡分散，时间为10-20min，温度控制在4-10℃；所述超声波震荡分散的具体操作为：采用超声波横波斜探头，将探头伸入液下1cm，并与液面呈45度夹角，频率为25KHz，脉冲时间为10s；

S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；

(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒

S1：取浓度为3-5mg/ml的酶蛋白溶液在1.5-3.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理2-3次；

S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2-3倍体积比的培养基质液混合，调节pH至6.8-7.3；所述培养基质液包括：1.8-2.2wt％磷酸二羟基丙酮、0.5-0.7wt％脱氧胆酸钠、2.1-2.4wt％海藻糖、1.1-1.4wt％半胱氨酸，余量为30mM磷酸缓冲液；

S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:50-60；

S4：30℃恒温孵育40-60min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，并且分3次补充葡萄糖，葡萄糖添加总量为25mg/L；所述石墨电极制造脉冲生物电的具体操作为：所述的脉冲频率为400Hz，脉冲强度为1-6mv/cm，每间隔5min脉冲处理100-500μs；所述葡萄糖的添加方法为：第一次12mg/L，第二次8mg/L，第三次5mg/L，每次间隔10min；

(4)酶-改性磷脂微囊的分离

S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；

S2：装入密封超滤膜，通入惰性气体，正压过滤16-24h；所述正压过滤的压力为3-8bar；惰性气体为氮气或者氩气；

S3：真空冷冻干燥得到酶-改性磷脂微囊固体粉末。