[发明专利]一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法

说明书

本发明公开了一种仿生嵌入固定化酶‑改性磷脂微囊的制备方法，包括以下步骤：(1)改性磷脂的制备；(2)改性磷脂微粒的制备；(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒；(4)酶‑改性磷脂微囊的分离。本发明通过电磁‑超声耦合处理对磷脂进行改性，可改变其空间结构，有利于酶蛋白的嵌入，并且能提高嵌合的稳定性，利用培养基质液及制造脉冲生物电，模拟仿生环境，提高酶活力，从而提高酶蛋白嵌入成功率。利用本发明的方法制备的酶‑改性磷脂微囊作为药物载体，相较于普通纳米脂质载体，药物的溶解度可提高1.9‑2.1倍。

技术领域

本发明涉及膜酶活性科研实验研究技术领域，具体涉及一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法。

背景技术

生物膜的组分繁多，分离纯化的难度较大，因此早年为便于研究，往往采用单一或几种脂质组成的各种人工膜结构：单分子层膜、累积膜、脂质体、平板双分子层脂膜等，同时，生物膜上还有大量的酶结合位点，也可将蛋白质嵌入后组成重建膜，这些膜结构泛称“人工膜”。

1965年，英国学者Bangham A D把磷脂分散到过量水中，形成了一种由双分子膜组成的闭合磷脂微囊，这一发现开创了新的研究领域。人工磷脂微囊具有类似于生物膜的结构，构成双分子层的类脂亲水性的头部形成膜的内表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间，这种类膜结构使其能够包裹多种物质。因此，近些年利用脂质体可以和细胞膜融合等特点制备脂质体载体药物是人工膜的另一项比较大的拓展。

为了解决溶解性差药物的低口服生物可利用率的问题，利用磷脂或卵磷脂等脂质体形成的生物膜制备的药物载体，通过将难溶药物进行包裹，提高药物溶解度，进而提高药物的利用率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：以往的人工磷脂微囊形成方法不同，所形成的磷脂微囊与酶蛋白的嵌合率低，影响其作为药物载体的成效，使得口服药物生物利用率降低。从而提供一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法。

本发明的技术方案为：一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)改性磷脂的制备

S1：将磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为3-5％的磷脂溶液；

S2：将所述磷脂溶液在惰性气体氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；

(2)改性磷脂微粒的制备

S1：向所述改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25-26℃；

S2：在惰性气体氛围保护下进行超声波震荡分散，时间为10-20min，温度控制在4-10℃；

S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；

(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒

S1：取浓度为3-5mg/ml的酶蛋白溶液在1.5-3.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理2-3次；

S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2-3倍体积比的培养基质液混合，调节pH至6.8-7.3；

S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:50-60；

S4：30℃恒温孵育40-60min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，并且分3次补充葡萄糖，葡萄糖添加总量为25mg/L；

(4)酶-改性磷脂微囊的分离

S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；