[发明专利]一种适于香菇菌褶担子细胞形态观察的切片制备方法

说明书

本发明涉及一种适于香菇菌褶担子细胞形态观察的切片制备方法，包括：固定；脱水；浸蜡；包埋；修蜡与切片；展片与烤片；脱蜡；染色与封片。本发明步骤简单，成本低，安全环保，使香菇菌褶担子细胞适于荧光染料染色并被清晰观察，从而为香菇形态发育和生理学研究提供真实有力的结构学证据，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物组织学技术领域，特别涉及一种适于香菇菌褶担子细胞形态观察的切片制备方法。

背景技术

香菇(Lentinusedodes)是我国重要的栽培食用菌之一，具有重要的食药用的价值。

细胞是组成有机体形态和功能的基本单位，是生物体的生理功能及一切生命现象的基本单位。细胞形态学观察可使生物体的遗传、发育以及生理机能理论得到发展和证实。目前在香菇的相关研究中，在子实体细胞学层面对其进行结构的研究还比较少见，这一缺失的重要细胞学例证极大限制了香菇生理、病理和形态学的研究进程。

菌褶是担子菌子实体的重要组成部分，其上的子囊体是孢子生长发育的重要场所，因此对菌褶的显微观察是担子菌遗传及其生活史研究的重要方法之一。一般真菌子实体菌褶观察中采用的徒手切片一般厚度在15μm以上，而香菇菌褶上担子细胞排列致密，采取徒手切片法的担子细胞重叠严重，很难清晰观察到单个担子细胞形态，给香菇担子观察及遗传研究带来很大困难。采取传统石蜡切片法，虽可获得8-10μm左右的菌褶样品，但操作中一般涉及50-60℃左右的融蜡过程，对香菇细胞壁、细胞核、染色体等存在一定伤害，同时观察效果也不理想。在目前香菇子实体发育研究文献中，采用石蜡切片法获得的菌褶切片图像模糊，其担子细胞较难分辨。不仅如此，在其他食用菌中如珊瑚猴头和亚侧耳的研究中，采用徒手或石蜡切片获得图像也存在类似情况。而解决这一问题的相关公开专利目前也比较少见。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种适于香菇菌褶担子细胞形态观察的切片制备方法，采用低熔点多聚蜡代替传统石蜡并采用VBL进行荧光染色，克服了传统石蜡切片或徒手切片法获得的菌褶切片图像模糊，其担子细胞较难分辨的缺陷。

本发明提供了一种适于香菇菌褶担子细胞形态观察的切片制备方法，包括：

(1)选取新鲜香菇菌褶组织作为切片的试验材料；将所选的试验材料切块，放入FAA固定液中于室温下固定；随后将经固定的试验材料脱水；

(2)将经脱水的试验材料置于乙醇与低熔点多聚蜡的混合溶剂中，放置在烘箱中直到乙醇挥发完全；待乙醇挥发后，继续放置12～18h；

(3)对包埋盒及经步骤(2)处理的试验材料进行预热，随后先在包埋盒中加入低熔点多聚蜡，再将试验材料夹入包埋盒中，室温下静置待低熔点多聚蜡完全凝固，将石蜡块取出，进行修蜡和切片；

(4)将步骤(3)得到的切片进行展片，待切片均匀展开后，用涂有粘片剂的载玻片进行捞片；将附着有切片的载玻片进行烤片，随后放入无水乙醇中脱蜡；

(5)向脱蜡后的载玻片滴加染色液进行染色，用PBS缓冲液冲洗，在载玻片中央滴入封片剂，用盖玻片封片，即可。

所述步骤(1)切块的工艺条件为：沿菌褶延伸方向切成长0.45～0.60cm、宽2～3mm的小块。

所述步骤(1)中的固定时间为16～20h。

所述步骤(1)中的脱水具体操作如下：用体积浓度为30％的乙醇冲洗1～2次，然后将试验材料放置于体积浓度为50％乙醇中30min，取出后再依次放置在体积浓度为70％、85％、95％的乙醇中各处理1h，最后放置在纯乙醇中处理2次，每次1h。

所述步骤(2)和(3)中的低熔点多聚蜡的制备方法如下：将聚乙二醇-400二硬脂酸酯(Polyethlene glycol-400distearate)和十六烷醇(1-hexadecanol)按照质量比9:1混合，于40℃烘箱中充分熔化制成。