[发明专利]一种获得铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌的方法

权利要求书

1.一种获得铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌的方法，其特征包括以下的步骤：

（1）采铁皮石斛成熟但果荚尚未裂的果实，将种子干燥后用2%次氯酸钠溶液消毒3分钟，无菌水漂洗3次后播种在制作好的MS培养基上，在光照强度为2000Lx-3000Lx,温度25℃±2℃，光周期12h/12h L/D的条件进行非共生萌发，得到无菌苗；

（2）选择铁皮石斛的原生境，目的是保证该环境中存在和铁皮石斛幼苗形成菌根的真菌；

将获得的无菌苗移栽到该原生境树木的树干上或者是岩石上，这样做的原因是铁皮石斛是附生植物，多生长在树木的枝干和岩石上；

并用尼龙绳固定，用该地苔藓覆盖铁皮石斛幼苗的根，以起到保湿的作用；

（3）定植成活后，每个月定期从采取铁皮石斛苗的根，进行显微镜观察，当发现根中有菌丝缠绕成团时，也就是形成菌丝团了，就可以进行菌丝团的分离；

（4）菌丝团的分离是将采回来的根依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗3次，用解剖针刮取菌丝团，用移液枪将菌丝团接种在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上进行培养；

（5）当接种的菌丝团生长出新的菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3-5次后，得到纯菌落；

（6）首先进行形态分类并分组，进行分子鉴定与保藏，所获得的铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌进行分子鉴定和Blast比对；分子鉴定中，采用CTAB法提取真菌DNA，PCR扩增所用引物为ITS1和ITS4；PCR扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序。

2.根据权利要求1所述的一种获得铁皮石斛(Dendrobium officinale)幼苗阶段菌根真菌的方法步骤（1）所述的把铁皮石斛的种子在无菌操作台上用2%次氯酸钠溶液消毒3分钟，无菌水漂洗3次后播种在制作好的MS培养基上进行非共生萌发，目的是得到无菌苗；步骤（2）选择铁皮石斛原生境，将无菌幼苗栽种在该自然生长点的树木的树干上或者是石头上，用尼龙线固定，并且用该地苔藓覆盖铁皮石斛幼苗的根，用苔藓覆盖的目的是有效得保持水分，选择原生境，保证该生境有铁皮石斛菌根真菌；步骤（3）每个月定期从栽种的铁皮石斛苗取根，通过显微镜的观察，当发现根中有菌丝团时，进行菌丝团的分离，这样可以及时得到菌根真菌的侵入情况，这样保证分离的菌根真菌来自幼苗阶段；步骤（4）无菌苗比喻为“陷阱”，把其栽种在原生境中，为了“捕捉”对铁皮石斛幼苗阶段的菌根真菌，该步骤就是把“猎物”分离出来，也就是用铁皮石斛无菌苗诱导菌根真菌侵入后分离与鉴定；步骤（6）所述的分子鉴定中，采用CTAB法提取真菌DNA，PCR扩增所用引物为ITS1和ITS4；PCR扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序。

3.总之，以上所有步骤为之后获得对铁皮石斛幼苗阶段的有促进作用的共生真菌节省了大量的人力和物力，这是一种新颖获得幼苗阶段菌根真菌的方法。

4.根据权利要求1或2所述的一种获得铁皮石斛(Dendrobium officinale)幼苗阶菌根真菌的方法，本发明在一个铁皮石斛的原生境，分离得到铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌，三次都分得了菌根真菌Tulansnellaceae，分子鉴定其与美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov ）进行了Blast比对，获得的菌根真菌都采用试管斜面法保藏。