[发明专利]一种获得铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌的方法

说明书

本发明涉及一种获得对兰科植物幼苗阶段菌根真菌的方法，具体来说涉及一种获得铁皮石斛(Dendrobium officinale)幼苗阶段菌根真菌的方法，通过铁皮石斛种子在MS培养基上进行非共生萌发，得到铁皮石斛无菌幼苗，移栽到有野生铁皮石斛生长的原生境，一定时间后通过镜检发现有真菌侵入幼苗根中，当形成菌丝团后，采集幼苗的根从中分离得到菌根真菌菌，进行纯化培养，先进行形态鉴定分组，再进行分子鉴定并保存。这种行新的方法，为获得促进幼苗阶段菌根真菌奠定了一定基础。本发明利用铁皮石斛幼苗阶段和菌根真菌的关系为培育种苗开辟了一条新的途径。

技术领域

本发明涉及一种获得对兰科植物幼苗阶段的菌根真菌的方法，具体来说涉及一种获得铁皮石斛(Dendrobium officinale)幼苗阶段菌根真菌的方法，把无菌苗移栽在原生境，诱导幼苗产生菌根真菌，再从该幼苗中分离、培养铁皮石斛幼苗阶段的菌根真菌的方法。

背景技术

铁皮石斛为珍贵的兰科药用植物，由于长期掠夺性采挖，野生资源遭到严重破坏，现已经被列为国家重点保护珍稀濒危物种。由于兰科植物种子细小，萌发困难，同时无性繁殖系数低，加上其生长发育需特殊的生态环境，给此类药材大面积栽种造成很大困难。我国已陆续报道铁皮石斛人工试管繁殖方面的研究，但试管苗出瓶问题一直没有得到很好解决，幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。有效真菌的获得目前多采用从成年野生铁皮石斛植株的根中分离，但由于成年铁皮石斛根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得促进铁皮石斛幼苗生长的有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐，同时，铁皮石斛不同生活史阶段的有效真菌与成年铁皮石斛根中的有效共生真菌是否相同目前仍不确定。由于野外铁皮石斛野生铁皮石斛石斛极为稀少，得到自然生长的铁皮石斛幼苗更为困难。因此，通过该方法，可以获得幼苗阶段的菌根真菌，这为开展珍稀濒危兰科植物回归和发展石斛产业中所需的有效共生真菌奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于发展出一种获得铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌的方法。

将铁皮石斛的种子进行非共生萌发，得到无菌苗，将无菌苗栽种在铁皮石斛的原生地，定期采集新长出来的根进行镜检，如果发现根中形成菌丝团，将根表面用2%次氯酸钠消毒，挑取菌丝团，在无菌条件下用人工培养基培养，诱导幼苗根中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落，并进行真菌的分子鉴定和保存。本发明的获得对铁石斛幼苗阶段有效共生真菌的方法，其特征包括以下的步骤：

（1）采铁皮石斛成熟但果荚尚未裂的果实，将种子干燥后用2%次氯酸钠溶液消毒3分钟，无菌水漂洗3次后播种在制作好的MS培养基上，在光照强度为2000Lx-3000Lx,温度25℃±2℃，光周期12h/12h L/D的条件进行非共生萌发，得到无菌苗；

（2）选择铁皮石斛原生境，目的是保证该环境中有利于铁皮石斛幼苗阶段的真菌。将获得的无菌苗移栽到该原生境树木的树干上或者是石头上，这样做的原因是铁皮石斛是附生植物，多生长在树木的枝干和石头上。并用尼龙绳固定，用该地苔藓覆盖铁皮石斛幼苗的根，以起到保湿的作用；

（3）每个月定期从栽种的铁皮石斛苗中取根样，通过显微镜的观察，当发现根中有菌丝团时，就可以进行菌丝团的分离；

（4）菌丝团的分离是将采回来的根依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗3次，用解剖针刮取菌丝团，用移液枪将菌丝团接种在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上进行培养；

（5）当接种的菌丝团生长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3-5次后，得到纯菌落；

（6）进行分子鉴定与保藏。本发明分离出铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌，分子鉴定其与美国国立生物技术信息中心数据库 (NCBI, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov ）进行Blast比对，获得的菌根真菌都采用斜面保存法；