[发明专利]大菱鲆蛋白质二硫键异构酶A3的重组蛋白及其制备和应用

说明书

本发明提供了一种大菱鲆蛋白质二硫键异构酶A3的重组蛋白及其制备和应用，属于分子生物学技术领域，所述的重组蛋白为蛋白质二硫键异构酶A3,简称SmPDIA3,重组蛋白的基因序列为SEQ ID NO.1。本发明还提供了利用体外重组表达技术获得了大菱鲆蛋白质二硫键异构酶A3蛋白SmPDIA3的方法，所述方法获得的SmPDIA3蛋白可以显著提高变性蛋白的复性率，在开发新的蛋白体外融合表达载体、变性蛋白复性添加剂等方面具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体说是一种大菱鲆蛋白质二硫键异构酶A3的重组蛋白及其制备和应用。

背景技术

蛋白质合成是每一个真核生物中必然发生的生物过程，其中蛋白折叠也是必需的，而目前为止仅有两个酶能够催化这一进程:一个是蛋白质二硫键异构酶(PDI)，另一个是肽基脯氨酸异构酶(PPI)。蛋白二硫键异构酶于1963年首次由Goldberger等学者发现，后来由Anfinsen等学者从人肝组织中分离纯化出来，并测定了其分子结构。典型的PDI分子结构包括三个部分：两个包含CXXC活性位点的硫氧还原蛋白活性结构域，负责催化蛋白质二硫键的氧化、还原和异构化；两个没有活性位点的底物结合结构域，负责底物和酶的特异性结合；一个C-末端的内质网驻留信号，负责将酶锚定在内质网上。

除了作为蛋白折叠酶催化二硫键的形成，PDI还具有其他方面的生理功能。例如：PDI通过参与免疫细胞对病毒的融合和吞噬过程，在免疫反应中发挥着重要作用；PDI还可作为分子伴侣，既能帮助新生蛋白质的正确折叠，又能使错误折叠与未折叠蛋白恢复生物活性；PDI家族成员还可参与精子与卵细胞的融合过程，而且可能与卵巢的早期发育有关；此外,PDI还与酵母生孢反应、小鼠体内血栓形成、前胶原成熟加工、内质网中抗坏血酸盐的积累、T细胞抗原呈递等多种生物过程有关。

温度是鱼类生活史中一种非常重要的环境因子，它不仅影响着鱼类的摄食、胚胎发育、标准代谢，而且可以影响鱼类的免疫反应、氧化还原酶活性、消化酶活性等生命活动。研究发现，在适宜的温度范围内，鱼体温度随着环境温度的升高而相应上升，大脑、心脏、肝脏等维持生命的重要组织器官活性增强，各种酶的活性提高，生理生化反应速率加快，细胞生理代谢增强，基础代谢速度增强，新陈代谢周期缩短,鱼体内的氧消耗量增加，鱼类的耗氧率增大。研究鱼类的温度胁迫响应机制，发掘功能基因，有助于培育抗高温新品种，从根本上解决温室效应引起海水升温对养殖业造成的危害问题，同时还可以开发具有我国自主知识产权的海洋基因工程蛋白/酶制品，解决一些科研或者生产难题。因此阐述鱼类PDIs的结构和功能具有十分重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种大菱鲆蛋白质二硫键异构酶A3的重组蛋白及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种大菱鲆蛋白质二硫键异构酶的重组蛋白，所述重组蛋白为蛋白质二硫键异构酶A3,简称SmPDIA3,所述重组蛋白的基因序列为SEQ ID NO.1。

本发明还提供一种大菱鲆蛋白质二硫键异构酶A3的重组蛋白制备方法,其特征在于所述方法的步骤如下:

(1)以大菱鲆SmPDIA3基因编码区为模板，采用P1和P2引物进行PCR扩增，待用；

(2)pET-28a载体以BamH I/Hind III酶切，待用；

(3)将步骤(1)的PCR扩增产物与步骤(2)酶切后的pET-28a载体通过In-Fusion HD酶重组，转化，测序鉴定,提取阳性克隆质粒，完成克隆载体构建；

(4)将步骤(3)构建的载体转入E.coil transettea(DE3)表达菌株中进行诱导表达，而后纯化、浓缩，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白SmPDIA3；

所述引物P1和P2的序列分别为P1：