[发明专利]新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重荧光定量PCR检测引物、试剂盒及应用

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重荧光定量PCR检测引物对及特异性探针的应用。本发明建立的多重荧光定量PCR体系可准确检测新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的单一或混合感染，并对该多重荧光定量PCR体系进行了优化，确定了最佳的引物浓度和最佳的探针浓度，使检测精度更高，在病毒鉴别领域具有重要优势。

技术领域

本发明涉及一种病毒检测技术，具体涉及一种用于鉴定新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的荧光定量PCR检测引物、探针组合物及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

星状病毒属于星状病毒科(astroviridae)星状病毒属(astrovirus)，根据宿主不同分为两个属：哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽类星状病毒属(Avastrovirus)。禽星状病毒属现有3个属(Avastrovirus 1-3)，包括鸭星状病毒(Duck astrovirus)、鸟肾炎病毒(Avian nephritisa strovirus)、火鸡星状病毒(Turkey astrovirus)等，火鸡星状病毒是其代表种。星状病毒是单股正链、无囊膜的小RNA病毒，其基因组长度大约6.8kb，，从5′端至3′端共包含4部分：1个85个核苷酸的5′端非编码区、3个开放阅读框(Open readingframes,ORFs)(ORF1a、ORF1b、ORF2)、1个80个核苷酸的3′端非编码区、1个30个核苷酸的多聚腺苷酸尾巴。2017年以来，我国山东、江苏、河南、广东及安徽等地的雏鹅群中陆续出现以内脏出现尿酸盐沉积和关节痛风为主要症状的传染性疾病，该病主要发生于20日龄以内的雏鹅，死亡率高达30％～50％。给我国的养鹅业造成巨大的经济损失。经病原学鉴定，引起雏鹅出现痛风症状的病原为新型星状病毒。

鹅副黏病毒病的病原为鹅黏病毒(Goose paramyxovirus，GPMV)，属副黏病毒科副黏病毒属。病毒广泛存在于病鹅的内脏器官内(脾脏、肝脏、肠管等)。在电子显微镜下观察，病毒颗粒大小不一(平均直径为120纳米)，形态不正，表面有密集纤突结构，病毒内部由囊膜包裹着螺旋对称核衣壳。分离的毒株接种10日龄发育鸡胚后能迅速繁殖，鸡胚在接种后2～3天死亡。鹅黏病毒能凝集鸡的红细胞，人工感染鸡可引起死亡。根据流行特点、临床症状和病理变化，可以作出初步诊断。确诊则需要进行病原诊断。

鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)是小鹅瘟的病原体。自1965年以来，许多国家曾报道了鹅细小病毒(GPV)病。小鹅瘟的临床特征主要以败血性病变表现为主，根据病程的长短分为最急性、急性和亚急性三种类型。该病具有传播速度快、发病率和死亡率较高的特点。目前，小鹅瘟病的流行爆发还很难控制，一旦发生流行小鹅瘟这种传染病，会给养鹅业造成巨大的经济损失。

随着分子生物技术的快速发展，针对病原微生物的核酸建立很多检测方法，这包括PCR检测技术、核酸探针杂交技术、环介导等温扩增技术(LAMP)等。其中PCR技术是分子生物学重要研究手段之一，该方法省时，简便，经济实用，大大提高了临床样品的检测效率。在单重PCR的基础上，建立了多种新型的PCR技术，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、多重荧光定量PCR技术、反转录PCR技术等。其中，实时荧光定量PCR被公认为PCR诊断技术的一次质的飞跃。荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模板的量。目前没有使用多重荧光定量PCR方法来同时检测新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的记载。

发明内容

为了解决以上现有技术中未有使用多重荧光定量PCR方法来同时检测新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的记载，本发明以新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒三种病毒为研究对象，建立了多重荧光PCR检测方法。