[发明专利]一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法

说明书

本发明公开了一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，包括：于培养皿内石英砂上均匀摆放微孔滤膜圆片，用移液枪转移AMF孢子至微孔滤膜表面，每片微孔滤膜转移1个外观饱满的新鲜收集的孢子，盖好皿盖，20‑28℃暗培养；取白三叶草种子，浓硫酸表面消毒后催芽；将萌发的孢子连同微孔滤膜圆片一起转移至折叠的浸湿滤纸内，同时转接一颗刚长出真叶的白三叶草幼苗；用1/2强度的霍格兰营养液浸润花盆中的河沙，将携带孢子和白三叶草的滤纸片垂直放入花盆的河沙中；白三叶草生长1个月后检查AMF侵染情况；将成功侵染的白三叶草移栽回花盆，继续培养4个月后收获。本发明单孢扩繁成功率高，耗时短。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法。

背景技术

丛枝菌根真菌（AMF）是一类不能纯培养的植物共生菌，在对AMF共生机制及生理生化的研究中往往需要获得较为纯净的AMF材料，单孢扩繁是从野外环境获取AMF纯净材料的重要方法。

目前单孢扩繁主要采用指形管法，即在指形管中对三叶草接种单个孢子，一般4个月后检查结果并进一步扩繁。由于AMF繁殖周期较长，加上野外采集的AMF孢子活力较低，同时在使用指形管的扩繁过程中无法检测是否成功侵染，使得这种方法耗时较长且成功率很低。Brundrett等在1996年《菌根在林业和农业中的应用》p158-159中提出了一种AMF的单孢扩繁方法：首先进行AMF孢子萌发实验，随后选取萌发的孢子接种三叶草。该方法在一定程度上弥补了以上指形管法的缺陷，但由于孢子转移过程可能对孢子产生损伤，另外根系在基质中的生长方向不确定，很难保证萌发的菌丝能够侵染根系，因而这种方法的成功率也很低。目前为止，受限于野外采集的孢子活力较低和根系及菌丝生长的随机性，常规单孢扩繁方法需要6-8个月的周期且成功率不到10%。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种单孢扩繁成功率高，耗时短的丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法。

本发明目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明的一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，包括以下步骤：

（1）在灭菌培养皿中加入灭菌石英砂，用蒸馏水浸润石英砂，于培养皿内石英砂上均匀摆放微孔滤膜圆片，用移液枪转移AMF孢子至微孔滤膜表面，每片微孔滤膜转移1个外观饱满的新鲜收集的孢子，盖好皿盖，20-28 ℃暗培养；

（2）取白三叶草种子，浓硫酸表面消毒5-10min无菌水冲洗后20-28℃催芽；

（3）准备河沙，于烘箱内灭菌，将灭菌的河沙装入花盆中待用；

（4）打开皿盖，于解剖镜下检查孢子萌发情况，将萌发的孢子连同微孔滤膜圆片一起转移至折叠的浸湿滤纸内，同时转接一颗刚长出真叶的白三叶草幼苗；

（5）用1/2强度的霍格兰营养液浸润花盆中的河沙，将携带孢子和白三叶草的滤纸片垂直放入花盆的河沙中；

（6）白三叶草生长1个月后，将滤纸取出，展开滤纸，于解剖镜下检查AMF侵染情况；

（7）将成功侵染的白三叶草移栽回花盆，继续培养4个月后收获。

上述的的一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，其中：微孔滤膜圆片为微孔滤膜用打孔器制取。

上述的的一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，其中：滤纸、玻璃培养皿、蒸馏水和石英砂与微孔滤膜圆片一起高压蒸汽灭菌。

上述的的一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，其中：折叠的浸湿滤纸是将滤纸对折两次后用灭菌蒸馏水浸湿。