[发明专利]一种测定人血浆中阿帕替尼药物浓度的方法

权利要求书

1.一种测定人血浆中阿帕替尼药物浓度的方法，采用高效液相色谱串联质谱进行检测，其特征在于，包含以下步骤：

(一)标准工作液的配制

精确称取阿帕替尼标准品1.02mg置于1.5mL离心管中，准确加入1.02mL纯甲醇溶液进行溶解，得到标准储备液A，即浓度为1mg/mL的阿帕替尼溶液，将标准储备液A用纯甲醇溶液进行稀释，稀释成0.04-40ug/mL浓度的阿帕替尼溶液，并在-80℃条件下保存；

(二)内标工作液的配制

准确称取贝那普利拉标准品1.0mg置于1.5mL离心管中，准确加入1.0mL纯甲醇溶液进行溶解，得到标准储备液B，将标准储备液B用纯甲醇进行稀释，得到浓度为5ug/mL的内标工作液，并在-80℃条件下保存；

(三)检测血液的离心

取待检测血液至少2mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血浆，上述血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；

(四)待测样本处理

(1)用移液枪移取10μL步骤(二)中所述内标工作液于1.5mL离心管中，加入50μL步骤(三)中所述血浆，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合1min；

(2)用移液枪移取200μL含0.1-0.3％甲酸的甲醇溶液加入步骤(1)的离心管中，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合2min，在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；

(3)用移液枪移取步骤(2)中的上清液20μL与1.5mL离心管中，加入380μL复溶液，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合2min，得到的溶液即为待测样品；

(五)待测样品的测定

(4)标准曲线的制备

首先将(一)种八种不同浓度的标准工作液50μL分别和950μL正常人空白血浆混合制成标准工作血药，按照(四)中的步骤进行处理，得到的标曲样品进仪器进行检测，得出上述九种标准溶液的阿帕替尼和内标色谱图，在色谱图中分别得到标准目标物峰面积和内标物峰面积，以标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以标准工作液配制后血浆中待测目标物血药浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y＝a×x+b，并且得出权重系数a和b。

(5)待测样品的测定

使用高效液相色谱串联质谱分析仪器对上述步骤(3)中待测的样品进行监测，得出上述待测样品的阿帕替尼和内标色谱图，在上述阿帕替尼和内标色谱图中得到待测目标物峰面积和内标峰面积，带入到(4)中的标准曲线方程中计算阿帕替尼的浓度。

(六)HPLC-MS/MS条件

色谱条件：采用ZORBAX Eclipse Plus C18 3.5μm，4.6×100mm色谱柱；柱温为35℃。流动相A相为甲醇，B相为含0.1％甲酸的水以65:35比例进行等度洗脱。流速0.5mL/min,进样量5μL，分析时间3.8min。

质谱条件：采用电喷雾离子源，在正离子电离模式下，选择多反应检测模式的质谱扫描方式进行测定，阿帕替尼与内标贝那普利拉母离子分别为398.2、397.18,子离子分别为212、351.1，保留时间分别为3.2、2.6min。

2.如权利要求1所述的测定人血浆中阿帕替尼药物浓度的方法，其特征在于：所述标准工作液浓度指标准工作液中所含有阿帕替尼的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有贝那普利拉的浓度。

3.如权利要求2所述的测定人血浆中阿帕替尼药物浓度的方法，其特征在于：步骤(一)中使用九种不同浓度的标准工作液。

4.如权利要求3所述的测定人血浆中阿帕替尼药物浓度的方法，其特征在于：九种不同浓度的标准工作液分别含有0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、4.0、10.0、20.0、40.0ug/mL浓度的阿帕替尼溶液。

5.如权利要求1所述的测定人血浆中阿帕替尼药物浓度的方法，其特征在于：步骤(3)中使用的复溶液为65％甲醇-35％含0.1％甲酸的水。