[发明专利]一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法

权利要求书

1.一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，其特征在于，所述水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法包括：

步骤一：取新鲜水稻植株，在-80℃进行冻干处理，研磨成细粉状，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取水稻植株的DNA；

步骤二：引物：检测Pi25的引物对为CAP1F/R的引物序列，限制性内切酶为HincII；

步骤三：基因组DNA提取：用CTAB法提取水稻基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶检测水稻基因组DNA；

步骤四：PCR扩增：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，73℃延伸30s，35个循环；73℃延伸3min；

步骤五：酶切：取15μL的利用CAP1引物PCR扩增产物，加入3μL酶切缓冲液，1.5μLHincⅡ限制性内切酶，补ddH₂O 5μL至20μL体系，37℃对产物酶切位点进行酶切；

步骤六：电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相。

2.如权利要求1所述的水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，其特征在于，所述步骤四中，PCR扩增体系为3μL DNA模板、0.7U Taq聚合酶、3μL 10×PCR缓冲液、2.0μLdNTPs(2.5mmol/L)、0.7μL正向引物(10μmol/L)和0.7μL反向引物(10μmol/L)，ddH₂O补足至20μL。

3.如权利要求2所述的水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，其特征在于，所述步骤四中，所述PCR扩增采用PCR扩增仪对DNA片段进行扩增，在扩增过程中，采用GM(1，N)模型对PCR扩增仪的工作参数的数据进行建模，保持扩增过程工作参数控制的准确度，提高扩增质量；具体实施如下：

(1)构造PCR扩增仪的数据时间序列，建立原始数据序：

选取被校正PCR扩增仪的测得值作为系统特征行为变量而对应的检测量设定为因子变量实验温度为因子变量湿度为因子变量

(2)进行数据处理，取X⁽⁰⁾为x⁽⁰⁾的1-AGO序列，即为一次累加序列：

其中，称D为X⁽⁰⁾的一次累加生成算子；

(3)建立起行为与因子间的灰微分方程，PCR扩增仪的灰色GM(1，N)模型及对应的白化方程为：

式中：k＝1，2，3，…，n，a为模型的发展系数，反映预测数据x₁的发展态势，b为灰作用量，反映数据间的变化关系；为PCR扩增仪的白化背景值，反映信息浓度的大小；

(4)通过对灰色模型在最小二乘法准则下的处理，可以得到：

且白化方程时间响应为：

式中：k＝2，3，…，n，B为GM(1，N)模型的系数矩阵，Y为行为变量矩阵；

(5)以上PCR扩增仪模型的建立以及运算，得到GM(1，N)模型在对应k处的预测值，其中通过累减生成算子可以得到：

(6)通过建立的GM(1，N)模型得到的在对应点处的预测值以及实际值比较，对PCR扩增仪采用的模型进行模型精度评价；

相对残差：

残差均值：

模型精度：

4.如权利要求1所述的水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，其特征在于，所述步骤六中的电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相；所述电泳，电泳仪内设有微型稳压器；稳压器中两个运放，均采用负反馈电路，且带隙电压基准电路的输出经过输出放大器的跟随结构直接输出，因此稳压器输出电压VOUT和偏移ΔVOUT：

其中R2/R3为带隙电压基准电路中的电阻比，V_EB1和V_EB2为NPN三极管Q1和Q2的发射极－基极电压，ΔV_IN1|diff和ΔV_IN2|diff分别为两级运放的输出电压偏移；

所述用凝胶成像系统对电泳胶进行照相，凝胶成像系统采用十字线灰度图像清晰度计算的改进模型，十字线灰度图像由mxn个像素构成，像素灰度值矩阵B(I，J)，其中0≤I≤m-1，0≤J≤n-1；

十字线灰度图像最大灰度值B_max，最小灰度值B_min，那么灰度差值的1/2用B_dif表示为：

灰度图像的清晰度为C，可得到十字线灰度图像清晰度改进模型为：