[发明专利]一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法

说明书

本发明属于分子植物学领域，公开了一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi‑25的检测方法，所述检测方法：取新鲜水稻植株，在‑80℃进行冻干处理，研磨成细粉状，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取水稻植株的DNA；引物：检测Pi25的引物对为CAP1F/R的引物序列，限制性内切酶为HincII；基因组DNA提取：用CTAB法提取水稻基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶检测水稻基因组DNA；PCR扩增：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，73℃延伸30s，35个循环；73℃延伸3min；酶切：取15μL的利用CAP1引物PCR扩增产物，加入3μL酶切缓冲液，1.5μLHincⅡ限制性内切酶，补ddH₂O 5μL至20μL体系，37℃对产物酶切位点进行酶切；电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相。

技术领域

本发明属于分子植物学领域，尤其涉及一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时甚至会造成颗粒无收。稻瘟病又名稻热病，俗称火烧瘟、吊头瘟、掐颈瘟等，是世界性的重要稻病，世界各稻区均可发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。目前，稻瘟病可能发生在各域内的任何年头、任何季节。稻瘟病是真菌寄生引起，病菌发育最适温病为25℃～28℃，高湿有利分生孢子形成飞散和萌发，而高湿度持续达一昼夜以上，则有利于病害发生流行。土壤温度低，阴雨连绵，日照不足有利于发病，大面积种植高优品种，抗病性差极易导致大面积发病。偏施、迟施氮肥，均易诱发稻瘟病。

源自籼稻品种谷梅2号的抗稻瘟病主效基因Pi-25，Pi-25定位于水稻第6染色体标记A7和RG456之间，对中国稻瘟菌菌系92-183(小种ZC15)有较强的叶瘟和穗瘟抗性。

现有的技术中，通常根据抗瘟表现对其进行判断，主要是水稻田间的自然鉴定、人工接种鉴定，工作量大，鉴别难度大、准确性差、研究人员室外工作时间长；其次采用分子标记辅助选择进行抗病育种时，所选用的多是与抗病基因连锁的SSR标记，该方法易造成假阳性的判断。综上，现有方法浪费大量的人力物力、工作量大、鉴别难度大、准确率低。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有的技术中，通常根据抗瘟表现对其进行判断，主要是水稻田间的自然鉴定、人工接种鉴定，工作量大，鉴别难度大、准确性差、研究人员室外工作时间长；

(2)采用分子标记辅助选择进行抗病育种时，所选用的多是与抗病基因连锁的SSR标记，该方法易造成假阳性的判断，鉴别不准确。

(3)现有技术中采用的PCR扩增仪在工作参数受温度、湿度的影响易波动，使得扩增的DNA质量差；电泳仪受电压的影响，出现波动引起电泳胶带出现模糊的现象，影响胶带质量；凝胶成像系统对电泳胶进行照相处理时，照片的清晰度不佳，电泳条带不清楚，影响对于结果的查看与分析。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，

本发明是这样实现的，一种稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，所述水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法包括：

步骤一：取新鲜水稻植株，在-80℃进行冻干处理，研磨成细粉状，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取水稻植株的DNA；

步骤二：引物：检测Pi25的引物对为CAP1F/R的引物序列，限制性内切酶为HincII；

步骤三：基因组DNA提取：用CTAB法提取水稻基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶检测水稻基因组DNA；