[发明专利]一种快速测试纳米颗粒对藻类活性影响的方法

权利要求书

1.一种能快速准确测试纳米颗粒作用下的藻细胞活性的方法，

其特征在于包括的步骤如下：

(1)藻类的培养及生长抑制测试参考标准ISO1442:1999和BS EN ISO8692：2004；

(2)将培养至对数期并经饥饿处理24h的藻类加入水体中，保证生长抑制实验保证藻细胞密度不低于10⁴cell/ml；去除实验保证藻细胞密度不低于10⁶cell/ml；

(3)设定光源为自然光、LED可见光，紫外光，生长抑制实验中可见光光照强度维持在液面处2000～10000Lux；去除实验中如需光照可设定紫外光辐照1～10mW/cm²，可见光强度为2～15mW/cm²，光照时间根据实验要求决定，若为异养生长则可减少周期光照时间，自养生长需保证每个周期12h以上的光照时间，去除实验光照时间在0～24h；实验温度设置在25～35℃之间；

(4)生长抑制实验取样间隔为24h，藻类去除实验取样间隔为1-6h；将取样后的藻液更换新的培养基，每次取100-400uL加入到孔板中，每组设置至少6个平行样，并加入1/10体积的细胞增殖试剂；在25～35℃下孵育4-12h，若光照会产生还原性物质，需在黑暗条件下孵育；所述细胞增殖试剂为一种高度水溶性的四唑盐；

(5)孵育完毕后，取上清液在酶标仪或分光光度计下读数，波长选择为450nm，并用公式计算抑制率，生长抑制实验的理论抑制率为正，去除实验的理论抑制率为负。

2.根据权利要求1所述能快速准确测试纳米颗粒作用下的藻细胞活性的方法，其特征在于步骤(4)所述生长抑制实验或藻类去除实验为：水体过滤、消毒后，加入试验藻液及纳米颗粒物后进行试验；抑制实验培养时间72～144h，灭活实验时间在1～96h之间，具体根据实际实验效果选择。

3.根据权利要求1所述能快速准确测试纳米颗粒作用下的藻细胞活性的方法，其特征在于步骤(4)所述孵育是：每隔固定时间取100～400uL藻液及10～40uL细胞增殖活性剂至孔板，若藻液浓度较高或过低可稀释浓缩至10⁴cell/ml，并更换培养液，每组样品至少取3个平行样，孵育4～12h使细胞贴壁后可以进行读数。

4.根据权利要求1所述能快速准确测试纳米颗粒作用下的藻细胞活性的方法，其特征在于步骤(5)所述读数：吸取孔板中的上清液，用酶标仪或分光光度计在450nm处读数，并取平均值；利用所测值根据公式计算纳米颗粒对藻类的抑制率或灭活率；

抑制率：

灭活率：

A_纳指包含纳米颗粒、藻类及培养液的实验组；A_对为含纳米颗粒、培养液但不含藻细胞的对照组；A_藻只含藻液、培养液；A_空为只含培养基的空白组。

5.根据权利要求3所述能快速准确测试纳米颗粒作用下的藻细胞活性的方法，其特征在于所用的细胞增殖试剂为(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐中的一种；四唑盐可与呼吸作用产生的脱氢酶反应生成水溶性甲瓒，不需要洗涤溶解操作即可间接反映细胞增殖活性；所述在常温下至少可保存1个月，4℃保存12个月以上；每次使用藻液体积的1/10即可；测试结果可排除纳米颗粒及还原性物质带来的影响，不仅可用于纳米材料对藻类的生长抑制测试，还可用于藻类灭活测试。

6.根据权利要求3或5所述能快速准确测试纳米颗粒作用下的藻细胞活性的方法，其特征在于所述细胞增殖试剂为CCK-8或WST-1。

7.根据权利要求1或3所述能快速准确测试纳米颗粒作用下的藻细胞活性的方法，其特征在所述于孵育步骤中藻细胞的孔板接种密度需保证在10⁴～10⁵cell/ml，孵育后吸光度读数与细胞活性线性相关性最好。