[发明专利]一种快速测试纳米颗粒对藻类活性影响的方法

说明书

本发明涉及一种能快速准确测试纳米颗粒作用下的藻细胞活性的方法。其步骤为：藻液的培养制备及实验溶液的配置；藻类生长抑制或灭活试验，试验期间每隔固定时间后将试验后的藻液100～400uL滴入消毒后的细胞培养板，并取平行样；向孔板藻液加入藻液体积1/10的细胞增殖试剂，在暗处孵育4～12h，使细胞贴壁；吸取上清液在450nm处用酶标仪或分光光度计检测吸光度(OD)值。该法通过可溶性甲瓒的吸光度测定细胞线粒体酶活性，可间接反映细胞增殖活性，避免纳米颗粒对计数的干扰，精度较高，可在藻类抑制及灭除测试中作为有效参考值。本方法可用于测试污废水、河水、各类循环水、培养液等各种水体中纳米颗粒对包括蓝藻门、绿藻门在内的大多数藻类的作用效果。

技术领域

本发明涉及一种纳米颗粒对藻类活性影响的检测方法，可以快速评价纳米颗粒对藻类的抑制和杀灭效果，便于材料性能的优化。

背景技术

藻类作为一种简单的单细胞生物在食品、医药及环境领域都有较高的利用价值的同时，如蓝藻藻华、赤潮等藻类爆发却也会给水体生态带来灾难。研究证明，纳米材料对藻类生物可能存在毒性，对水体生态的修复起积极作用，但纳米材料对藻类的作用效果需使用一种较为简便准确的方法进行评价。现有的藻类细胞活性检测主要参照细胞体外毒性测试标准，如ISO1442:1999和BS EN ISO8692：2004，但此类标准均未明确给出纳米材料的藻类细胞毒性测试方法，且均采用细胞浓度值作为细胞活性标准，忽视了纳米颗粒引起的絮凝对结果造成的影响，且无法分辨活细胞和死亡细胞。部分文献使用荧光染色法计数虽可分辨活、死细胞，但对设备要求较高，且无法量化细胞的活性；专利(CN101201312A)发明了一种中性红染色法，不需用荧光试剂染色，但却无法避免纳米颗粒物的干扰，絮凝沉降的藻细胞仍具有增殖能力；叶绿素a测试法与细胞活性线性相关度较好，但当细胞活性负增长时其值与叶绿素含量相关性较差，且叶绿素在极端胁迫条件(强光、强酸强碱、高温)下易分解，故该法只适用于温和条件下的生长抑制实验；细胞增殖试剂法较为精确，可避免各种非可溶性杂质的干扰，但如MTT法等均较少藻类测试中使用，一方面因为MTT法产生的甲瓒不可溶，需将细胞溶解，步骤复杂，另一方面MTT法所用增殖剂的副产物有毒，藻类等需长时间测试，对实验结果及实验人员身体健康不利。

发明内容

本发明针对上述问题，采用一种高可溶性四唑盐利用细胞培养的手段检测藻细胞的活性，该方法操作简便，所需仪器简单，精度高，避免了不可溶杂质对实验结果的影响，比细胞浓度、叶绿素含量更便捷准确的反映了藻细胞活性的变化，更能精确地表现纳米颗粒对藻细胞活性的影响。适用藻细胞范围广，且可用于生长抑制实验及藻类去除试验中细胞活。

本发明中的测试方法通过以下步骤实现：

(1)藻类的培养及生长抑制测试可参考标准ISO1442:1999和BS EN ISO8692：2004。

(2)将培养至对数期并经饥饿处理24h的藻类加入水体中，保证生长抑制实验保证藻细胞密度不低于10⁴cell/ml。去除实验保证细胞密度不低于10⁶cell/ml。

(3)设定光源为自然光、LED可见光，紫外光等，生长抑制实验中可见光光照强度维持在液面处2000～10000Lux；去除实验中如需光照可设定紫外光辐照1～10mW/cm²，可见光强度为2～15mW/cm²，光照时间根据实验要求决定，若为异养生长则可减少周期光照时间，自养生长需保证每个周期12h以上的光照时间，去除实验光照时间建议在0～24h。实验温度可设置在25～35℃之间。

(4)生长抑制实验取样间隔为24h，藻类去除实验取样间隔为1-6h。将取样后的藻液更换新的培养基，每次取100-400uL加入到孔板中，每组设置至少6个平行样，并加入1/10体积的细胞增殖试剂。在25～35℃温度下孵育4-12h，若光照会产生还原性物质，需在黑暗条件下孵育。