[发明专利]一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法，取促血小板生成素模拟肽(TMP)与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联，制得KLH-TMP作为免疫抗原，加入福氏完全佐剂、乳化后，分批次免疫新西兰白兔，免疫后收集血清，分离纯化出抗TMP兔的多克隆抗体，其中TMP的碱基序列如SEQ IDNO:1所示，TMP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，其具体步骤为：

(1)取血小板生成素模拟肽(TMP)与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联，KLH-TMP融合蛋白纯度大于95％；

(2)取2.5mg的KLH-TMP作为免疫抗原，加入2.5ml福氏完全佐剂、乳化；

(3)取新西兰白兔，颈背部选择8点注射抗原，每点0.1-0.2mg抗原；

(4)在免疫后第15、29、43天，分别用4.5mg的KLH-TMP作为免疫抗原蛋白与4.5ml福氏不完全佐剂乳化，以同样的方式注射；

(5)在免疫后第53天后，进行耳缘静脉或肌肉加强免疫1ml无佐剂抗原；

(6)在免疫后第58天，颈动脉取血，将兔子处死；

(7)兔血在4℃放置过夜后，4000g离心收集上清，从中分离纯化出抗TMP兔的多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，KLH-TMP的免疫抗原的浓度为1mg/ml。

4.根据权利要求1至3任一所述的一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法，还包括以下纯化步骤：

(1)取离心收集的兔血清加入等体积生理盐水，搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和(NH₄)₂SO₄，于4℃静置沉淀3h以上后，4000g离心20min，弃去上清；

(2)以生理盐水溶解沉淀，再逐滴加入沉淀体积二分之一的饱和硫酸铵，于4℃静置沉淀3h以上后，4000g离心20min，弃去上清；

(3)重复第二步，将末次离心后的沉淀物用0.02M、pH 7.4的PBS溶解，以PBS充分透析，至萘氏试剂测透析外液无黄色；

(4)将透析袋内样品稀释后，以紫外分光光度计测蛋白含量。