[发明专利]一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及抗TMP兔多克隆抗体的制备方法，取促血小板生成素模拟肽(TMP)与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联，制得KLH‑TMP作为免疫抗原，用纯化后的抗原免疫新西兰白兔，收集兔子血液制备抗血清，从中分离纯化出抗TMP兔的多克隆抗体。该抗体血清经盐析法纯化后纯度可达85％以上。本发明制备的抗体具有高纯度、高特异性和高亲和力的特点。

技术领域

本发明属于基因工程制药领域，并具体地涉及微生物学、免疫学领域，特别涉及一种多克隆抗体的制备方法。

背景技术

血小板生成素(thrombopoietin,TPO)，又称巨核细胞生长发育因子(Megakaryocyte Growth Development Factor,MGDF)，是Kelemen等人于1958年发现的，在人体血液中存在的一种调节血小板生成的激素样物质。人TPO基因位于第3号染色体长臂上(q26-27)，其编码的TPO蛋白由332个氨基酸组成，含有两个功能区域：153个氨基酸组成的N端，以及179个氨基酸组成的C端(林放，2012)。TPO具有促进巨核细胞增殖、分化与成熟，促进血小板生成的作用，是首个被发现的、也是最重要的血小板生成调节因子。1997年，通过噬菌体展示技术，Cwirla等人筛选到一种与内源TPO无同源序列的14个氨基酸组成的TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)。

对于恶性肿瘤放疗和化疗、肝炎、爱滋病、以及骨髓移植等原因引起的血小板减少症，国内目前尚缺乏安全有效的治疗药物。虽然第一代重组促血小板生成素在90年代中期就进入了临床研发，但因其产生中和性抗体未能走出临床。目前，全球范围内仅在我国上市(rhTPO)。促血小板生成素模拟肽(TMP)与人体内源TPO非同源但具有良好的生物活性，美国安进公司将其与免疫球蛋白的Fc段融合，该融合蛋白克服了短肽TMP半衰期短的缺点，同时具有TPO活性，也不会产生中和性抗体。该融合蛋白已被美国FDA批准上市，用于治疗慢性特发性血小板减少症(ITP)。该融合蛋白的缺点是由于Fc为非惰性蛋白，它会带来免疫副作用。

合理的免疫程序是影响抗体产生的重要因素，现有的TMP抗体的生产成本较高、纯度较低并且特异性和亲和力较低。

多克隆抗体(Polyclonal antibodies,PcAb)是指由多种抗原决定簇刺激产生的混合抗体，具有生产成本低、生产周期短、对抗原亲和力强等优点(沈金儿，2013)。新西兰白兔性情温顺，容易饲养，是一种常用的实验室制备抗体的免疫动物；相对鼠源多克隆抗体，兔源多抗通常具有更高的亲和力和特异性，兔多克隆抗体制备技术也比较成熟。

钥孔血蓝蛋白(KLH,keyhole limpet hemocyanin)是具有高度免疫原性的蛋白大分子，作为载体蛋白用于免疫原的制备，交联于半抗原和其他抗原，可以增强它们的免疫原性。

本实验室自2009年开始，就致力于TMP长效融合蛋白的研究。通过人血清白蛋白融合技术，在专利CN 201310084212.8中公开了二聚体化促血小板生成素模拟肽TMP二联体一人血清白蛋白融合蛋白的制备及应用。

林放，三种血小板生成关键因子共转染人骨髓基质细胞的实验研究[D]，2012，第三军医大学

沈金儿，抗GNA兔单克隆抗体的制备及其夹心ELISA枪测体系的建立[D]，2013，浙江大学

发明内容

为了获得高效价、高特异性、高亲和力的抗TMP多克隆抗体，本发明采用少量、多次、长周期的免疫方法，并添加佐剂以增强机体产生的免疫应答，以新西兰白兔为免疫动物进行抗体制备。整个免疫过程为期58天，共免疫5次，抗体血清经盐析法纯化后纯度可达85％以上。本发明制备的抗体具有高纯度、高特异性和高亲和力的特点。

本发明提供抗TMP兔多克隆抗体血清的制备方法：