[发明专利]一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：试剂A，试剂B，试剂C，试剂D，试剂E，试剂F，试剂G，装有试剂H的检测管。本发明试剂盒检测的特异性和灵敏度高，采用磁珠提取核酸，可充分地将待测样品中的核酸提取出来，避免了使用大型的仪器设备，精简了繁琐复杂的操作流程，同时也极大缩短了核酸提取的时间；使用钙黄绿素染料可以严格遵守LAMP反应的不开盖原则，极大降低了假阳性率；本发明的试剂盒的整个操作过程简便，在1.5‑2个小时之内就可以完成检测，并且不需要高端的仪器设备。

技术领域

本发明涉及水产养殖中病原的检测技术，具体涉及虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)的检测试剂盒。

背景技术

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)，全称为肠道上皮细胞微孢子虫，属微孢子虫科，肠胞虫属，2009年在泰国生长缓慢的斑节对虾中被首次发现分离而命名。2013年，EHP在国内首次被发现。感染EHP的对虾表现摄食正常，但体色发白，肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，一般不会有大规模死亡现象，但是会造成对虾生长缓慢，造成饲料损耗，产量低，从而给渔民造成较大的经济损失。目前针对EHP还没有有效的治疗手段，及早发现并采取必要措施阻止病原传播是公认最有效的方法。因此建立灵敏、准确、快速、便捷的检测技术是减少虾肝肠胞虫病暴发的重要途径。

目前，诊断EHP的方法主要有：组织切片观察、原位杂交、PCR、实时荧光定量PCR等技术。这些方法多数需要昂贵精密的设备仪器，并且操作复杂，耗时长，需要专业技术人员操作，并不能满足现场快速诊断的要求。因此，目前迫切需要一种操作简单、结果准确可靠、结果判断直观、成本低廉的现场快速检测方法，为疾病的防控提供技术保障。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术，在60-65℃的恒温条件下，经过30-50分钟就可以完成核酸扩增反应。在LAMP反应体系中事先加入与Mn²⁺螯和的钙黄绿素，Mn²⁺可以使钙黄绿素的绿色荧光淬灭，当LAMP扩增反应发生后，产生的副产物焦磷酸离子与Mn²⁺结合并释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出绿色荧光，通过颜色的变化来判断反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便等特点，广泛应用于各种病原体的检测。目前，已有研究人员开发建立了EHP的LAMP检测技术，但由于传统病毒核酸的提取需要实验室的专业设备，操作较为繁琐复杂等问题，阻碍了LAMP检测技术在养殖过程中的推广应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种不需要实验室专业仪器设备，操作简便快速的虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：

试剂A：组织裂解液Ⅰ；

试剂B：组织裂解液Ⅱ；

试剂C：异丙醇；

试剂D：体积百分比浓度为65％-80％的乙醇水溶液；

试剂E：灭菌双蒸水；

试剂F：90-110mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；

试剂G：虾肝肠胞虫阳性质粒；

装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer 2.5μl，10mM的脱氧核糖核苷酸2.5μl，100mM的MgSO₄ 2μl，5M的甜菜碱1μl，

100μM的引物EHP-FIP 0.4μl，所述引物EHP-FIP的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；