[发明专利]一种适用于新鲜烟草叶片全蛋白的提取方法

说明书

本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种适用于苗期新鲜烟草叶片全蛋白的提取方法专利申请事宜。方法针对苗期新鲜烟叶适用，具体包括：制备提取液（采用裂解液RIPA、缓冲液NEB或PBS）、烟叶预处理、溶液法提取等步骤。初步测定结果表明，经过相关提取工艺参数优化后，本申请所提供提取方法的蛋白提取量虽然中等，但杂质少，蛋白提取效果更好，而且由于相关提取方法简单方便，耗时较短（仅1.5 h左右），因此使得本申请具有较好的科研价值，可为目标蛋白一般免疫印迹、免疫共沉淀等相关蛋白分析和研究奠定技术基础。

技术领域

本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种适用于苗期新鲜烟草叶片全蛋白的提取方法专利申请事宜。

背景技术

烟草作为一种较为特殊的经济作物，其产量与品质直接关系到我国国民经济的健康发展。为了研究烟草基因功能，创制新的育种材料，对基因表达产物蛋白质进行深入研究和分析显然具有十分重要的意义。

蛋白质研究中，蛋白样品的制备是分析的起始和基础，因此蛋白提取质量和效果对后续的研究分析有重要影响。而由于烟草叶片含有较厚的细胞壁，又给烟草蛋白质的提取增加了一定的难度。现有技术中，植物蛋白的提取方法主要有两种：溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取过程中采用了变性剂，会导致部分蛋白酶结构改变并失去活性，因此沉淀法并不适合烟草叶片全蛋白的提取。而在应用溶液法进行提取时，由于不同生物、以及不同生长时期的蛋白特性不同，因此具体提取时所选择的提取液及提取工艺也往往缺乏可借鉴性，往往均需重新设计。而针对烟草质量分析及新品种培育而言，建立一种针对新鲜烟草叶片的、简单快速高效的全蛋白提取方法，对于烟草功能基因研究和烟草新材料创制都具有十分重要的应用意义。

发明内容

本申请目的在于提供一种适用于苗期新鲜烟草叶片全蛋白的提取方法，从而为烟草生长代谢研究奠定一定方法学基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种适用于新鲜烟草叶片全蛋白的提取方法，该方法针对苗期新鲜烟叶适用，具体包括如下步骤：

（1）制备提取液，具体可采用裂解液RIPA、NEB或不同pH的PBS；配方组成为：

裂解液RIPA：Tris-Cl（pH 8.0）、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；

缓冲液NEB： Hepes（pH 7.5）、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；

pH 8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 9.5 mM，NaH₂PO₄、0.5 mM，PMSF、1mM；

pH7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 7.2 mM，NaH₂PO₄、2.8 mM，PMSF、1 mM；

pH 6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 1.2 mM，NaH₂PO₄、8.8 mM，PMSF、1mM；

（2）烟叶预处理

将栽培烟草K326（或者NC82）8-12叶期的新鲜烟叶，液氮速冻后，研磨成粉。

（3）溶液法提取

在步骤（2）研磨成粉烟叶样品中加入步骤（1）中制备的提取液（裂解液），震荡混匀后，冰上静置不少于1h；