[发明专利]一种提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活的提取方法在审
| 申请号： | 201811346922.2 | 申请日： | 2018-11-13 |
| 公开（公告）号： | CN109321537A | 公开（公告）日： | 2019-02-12 |
| 发明（设计）人： | 翟妞;张慧;陈千思;周会娜;刘萍萍;徐国云;郑庆霞;许亚龙;李晶;王晨;金立锋 | 申请（专利权）人： | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 |
| 主分类号： | C12N9/04 | 分类号： | C12N9/04 |
| 代理公司： | 郑州联科专利事务所(普通合伙) 41104 | 代理人： | 时立新 |
| 地址： | 450001 *** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 代谢酶 酶活 萜类 烟叶提取物 全蛋白 提取液 申请 烟叶预处理 蛋白分析 活性分析 技术基础 新鲜烟叶 杂质蛋白 代谢物 缓冲液 裂解液 溶液法 制备 耗时 烟草 科研 研究 | ||
1.一种提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活的提取方法，其特征在于，该方法针对新鲜烟叶中萜类代谢酶的提取，具体包括如下步骤：
（1）制备提取液，具体采用裂解液RIPA 、NEB或PBS；配方组成为：
裂解液RIPA ：pH 8.0的Tris-Cl、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；
缓冲液NEB： pH 7.5的Hepes、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；
（2）烟叶预处理
将烟草8-12叶期的新鲜烟叶，研磨成粉备用；
（3）溶液法提取
在步骤（2）研磨成粉烟叶样品中加入步骤（1）中制备的提取液，震荡混匀后，冰上静置不少于1h；具体用量方面，研磨成粉烟叶样品100mg，提取液用量为500μl-1mL；
静置完成后，5000~15000rpm离心不少于20min，保留上清液，即为含有萜类代谢酶的提取液。
2.如权利要求1所述提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活的提取方法，其特征在于，所述栽培烟草为K326或者NC82品种。
3.如权利要求2所述提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活的提取方法，其特征在于，步骤（1）中PBS的pH=8.0、7.2或者6.0，具体组成为：
pH=8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 9.5 mM，NaH2PO4、0.5 mM，PMSF、1 mM；
pH=7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 7.2 mM，NaH2PO4、2.8 mM，PMSF、1 mM；
pH=6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 1.2 mM，NaH2PO4、8.8 mM，PMSF、1 mM。
4.如权利要求3所述提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活的提取方法，其特征在于，步骤（1）中采用ph=8.0的PBS；步骤（3）中，提取液用量为1mL，5000 rpm离心20min。
5.如权利要求1所述提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活的提取方法，其特征在于，所述萜类代谢酶指：1-脱氧木酮糖还原酶和3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶。
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