[发明专利]一种提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活的提取方法

说明书

本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活专利申请事宜。该方法针对针对新鲜烟叶中萜类代谢酶的提取，具体包括：制备提取液（采用裂解液RIPA、缓冲液NEB或PBS）、烟叶预处理、溶液法提取等步骤。初步测定结果表明，提取液中DXR酶活得到了较好提高，可达3.5×10^‑4U/μg全蛋白，而HMGR酶活可达6.7×10^‑4U/μg全蛋白，较好达到了减少杂质蛋白干扰、提升DXR酶和HMGR酶含量的目的。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短（仅1.5 h左右），因此使得本申请具有较好的科研价值，可为DXR和HMGR活性分析及其它相关蛋白分析和研究奠定技术基础。

技术领域

本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活提取方法专利申请事宜。

背景技术

烟草作为一种较为特殊的经济作物，其产量与品质直接关系到我国国民经济的健康发展。为了研究烟草基因功能，创制新的育种材料，对烟草代谢物进行深入研究和分析显然具有十分重要的意义。

烟草中的香气物质是烟草内形成的一类次生代谢产物，目前按照致香功能团可分为酸类、醇类、酮类、醛类、酯类、酚类等，其中对烟草香气贡献最大的3 类物质分别为多酚类化合物、萜类化合物以及生物碱。其中萜类物质可分别由甲基赤藓醇4-磷酸途径(MEP)和甲羟戊酸途径(MVA)途径这2 条独立途径生成。DXR在MEP途径的第二步中催化DXP（1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸酯）生成MEP，在此步骤中，由于DXP被认为是硫胺素（维生素B1）和吡哆醇（维生素B6）的前体物，所以DXR催化DXP的步骤常被用于MEP途径中碳硫分流的研究，同时该步骤也是质体中萜类化合物合成的重要调控位点。而HMGR在MVA途径中催化3-羟基-3甲基-戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸，该过程是萜类合成过程中的重要步骤，而且该反应不可逆，所以将HMGR称为MVA途径中的第一个限速酶。由于1-脱氧木酮糖还原酶（DXR）和3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）在相关次生代谢产物中的关键性节点作用，因此对于这两个萜类代谢酶的深入研究，对于烟草生理生化的深入研究、以及烟草新材料鉴定、新品种培育都具有十分重要的意义。

现有技术中，植物蛋白（包括生物酶）的提取方法主要有两种：溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取过程中采用了变性剂，会导致部分蛋白酶结构改变并失去活性，因此沉淀法并不适合烟草叶片全蛋白的提取。而在应用溶液法进行提取时，由于不同蛋白（生物酶）特性不同，因此具体提取所选择的提取液及提取工艺也往往缺乏可借鉴性，往往均需重新设计。而现有技术中尚未见到较好的提取萜类代谢酶提取方法报道。

发明内容

本申请目的在于提供一种提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活提取方法，从而为烟草生长代谢研究奠定一定方法学基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种提高烟叶提取物中萜类代谢酶酶活的提取方法，该方法针对新鲜烟叶中萜类代谢酶的提取，所述萜类代谢酶主要指：1-脱氧木酮糖还原酶（DXR）和3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（HMGR），具体包括如下步骤：

（1）制备提取液，具体可采用裂解液RIPA 、NEB或PBS；配方组成为：

裂解液RIPA ：Tris-Cl（pH 8.0）、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；

缓冲液NEB： Hepes（pH 7.5）、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；

pH 8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 9.5 mM，NaH₂PO₄、0.5 mM，PMSF、1mM；