[发明专利]罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列及其克隆方法

权利要求书

1.一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列，其特征在于，所述半乳糖凝集素-3基因序列为SEQ ID NO：1。

2.权利要求1所述的罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其特征在于，所述半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法包括以下步骤：

1)构建罗非鱼抗病家系和易感病家系，使用无乳链球菌分别感染所述抗病家系和易感病家系的罗非鱼，获得感染后罗非鱼内脏组织转录组数据库；

2)将罗非鱼抗病家系的内脏组织转录组数据库与易感病家系的内脏组织转录组数据库进行比对，筛选获得差异表达显著的基因，对差异表达显著的基因进行功能归类分析，挑选与免疫抗应激相关的基因在数据库中进行比对，获得了半乳糖凝集素-3基因的部分mRNA序列；

3)使用常规PCR扩增所述mRNA序列，并对扩增产物进行测序验证，获得cDNA序列；

4)以所述cDNA序列为模板，利用RACE技术扩增该基因的5’和3’端，获得5’端扩增产物和3’端扩增产物，将所述5’端扩增产物和3’端扩增产物进行拼接，得到半乳糖凝集素-3基因的全长cDNA，将半乳糖凝集素-3基因的全长cDNA与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因进行比对，二者具有高度同源性，则说明所述半乳糖凝集素-3基因的全长cDNA为罗非鱼半乳糖凝集素-3基因。

3.根据权利要求2所述的罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其特征在于，所述内脏组织为脾脏或肾脏。

4.根据权利要求2所述的罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其特征在于，所述常规PCR所用的引物为：

galectin-3-F CCTCTTTGCCCCACTTTTCA；

galectin-3-R AGTGAGGGTGCGGTCTGATT。

5.根据权利要求2所述的罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其特征在于，RACE技术扩增所述cDNA序列的方法，包括以下步骤：

S1：根据所述cDNA序列设计RACE技术的特异引物，使用PCR扩增所述cDNA序列，将PCR特异扩增产物进行纯化、回收及克隆测序；

其中，扩增cDNA序列5’端的引物为：

galectin-3-g:AGAATCTGACGGTTCCCTTCAATCTGC-SP5′，

galectin-3-n:CCAGCCAACCCAGCGGACCTTG-GSP5′；

扩增cDNA序列3’端的引物为：

galectin-3-G:AGGCAGATTGAAGGGAACCGTCAGAT-GSP3′，

galectin-3-N：CAGCTGTTTCTGACGATCAGCTTCTTGC-GSP3′；

S2：将克隆测序后序列进行拼接，获得半乳糖凝集素-3基因的全长cDNA。

6.根据权利要求2所述的罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其特征在于，所述差异表达显著的基因为基因表达变化倍数大于2，并且FDR值小于0.05。

7.根据权利要求1所述的罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其特征在于，所述罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列含有1034bp个碱基，包括690个碱基的开放阅读框，所述开放阅读框编码229个氨基酸的蛋白，所述罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列存在4个内含子和5个外显子。

8.一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因应用，其特征在于，权利要求1-7任一项所述的半乳糖凝集素-3基因用于罗非鱼的抗病选育。