[发明专利]罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列及其克隆方法

说明书

本发明公开了一种罗非鱼的半乳糖凝集素‑3基因序列，该序列为SEQ ID NO：1，该序列的克隆方法包括以下步骤：1)构建罗非鱼抗病家系和易感病家系，使用无乳链球菌分别感染所述抗病家系和易感病家系的罗非鱼，获得感染后罗非鱼内脏组织转录组数据库；2)根据差异表达分析结果获得半乳糖凝集素‑3基因的mRNA；3)PCR扩增所述mRNA序列，获得cDNA序列；4)以所述cDNA序列为模板，利用RACE技术扩增该基因的5’和3’端，扩增产物进行拼接，得到半乳糖凝集素‑3基因的全长cDNA，将半乳糖凝集素‑3基因的全长cDNA与其他鱼类的半乳糖凝集素‑3基因进行比对，获得罗非鱼半乳糖凝集素‑3基因。本发明的SEQ ID NO：1能够辅助罗非鱼的抗病育种。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列及其克隆方法。

背景技术

罗非鱼是联合国粮农组织向全世界推广养殖的水产品种，也是我国淡水养殖的主导品种。近几年我国罗非鱼养殖面积约170万亩，产量约150万吨，出口约40万吨，已成为全球罗非鱼产量和出口量最大的国家。目前，罗非鱼已形成了集良种培育、苗种繁育、饲料生产、机械配套、规模养殖、产品加工与运销等一体的完整产业链，在国内是产业链最为完整的水产品种。过去十多年随着吉富罗非鱼的引进及规模化养殖模式的大面积推广，罗非鱼产业得到了飞速发展。但也出现了许多亟待解决的问题，其中以无乳链球菌和嗜水气单胞菌引起的细菌性疾病最为棘手，该病不但死亡率高，而且死亡速度和传播速度极快，给养殖从业者带来了严重的经济损失，已成为罗非鱼养殖过程中的“恶魔”。目前普遍采用抗生素药物进行防治，虽然短时间内可以有效的防治病害，但也会带来很多弊端，例如长期频繁使用抗生素及其它一些化学药物会引起病原物产生耐药性，药物在鱼类体内残留及对水环境造成污染等，对人类的生存环境和生命健康将会产生巨大的威胁。而依靠分子育种技术培育抗病品种在近几年中经常有报导，并取得了一定的进展。依靠这种方法虽然符合水产养殖无公害绿色发展的需求，但由于育种周期较长，制约养殖产业的快速发展。因此开展鱼类抗病基因工程的研究就显得尤为重要。

与罗非鱼免疫相关基因的研究已有大量的报道，如主要组织相容性抗原(MHC)IIA和II B基因、CD59基因、CD2BP2基因的克隆与表达分析、CC1趋化因子的分子克隆、功能分析及体外重组蛋白的抑菌活性分析。而凝集素在硬骨鱼类中具有多种的功能，其中免疫功能最为突出。已有研究表明，凝集素通过连接传染性病原菌表面的凝集细胞、沉淀多糖和复合碳水化合物而参与免疫或炎症反应。到目前为止，在鱼类中已经发现了5种凝集素家族成员，包括半乳糖凝集素、C型-凝集素、Lily型-凝集素、Rhamnose-凝集素和内凝集素。半乳糖凝集素是S型凝集素，作为一种模式识别受体，可以特异性的分子识别相关病原体，参与一系列免疫反应，如抗体调理、细胞吞噬、补体激活和微生物死亡等作用。在脊椎动物中，根据碳水化合物识别结构域(CRD)的结构特将其分为三种类型共16个基因，其中呈球型的CRD半乳糖凝集素有(galectin-1，2，5，7，10，11，13，14，15，16)、半乳糖凝集素-3和串联重复半乳凝素(半乳糖凝集素4，6,8,9，12)。半乳糖凝集素-3(galectin-3)是唯一一个连接到N-末端的一个C-末端碳水化合物识别结构域的嵌合半乳糖凝集素，在哺乳动物中，galectin-3在活化的T细胞、B细胞和炎性巨噬细胞等免疫细胞中广泛表达，同时在T细胞凋亡、炎和肿瘤中均发挥重要作用。目前，在斑点叉尾鮰中发现了两个同源的半乳糖凝集素-3基因，它们在斑点叉尾鮰的黏膜免疫中发挥了重要作用。目前，在鱼类中有关凝集素的研究报道还比较少，仅见在斑点叉尾鮰中发现了两个同源的半乳糖凝集素-3基因，它们均参与了黏膜免疫。但是到目前为止，在罗非鱼中，尚未见任何关于半乳糖凝集素-3基因的相关报导。

发明内容

作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，利用无乳链球菌或嗜水气单胞菌感染罗非鱼后，罗非鱼内脏中的免疫相关基因差异表达显著，通过分子生物学手段对差异表达显著的基因进行分析，发现差异表达显著的基因中含有与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因同源性较高的基因。基于这种发现，完成了本发明。