[发明专利]确定马铃薯StALDH基因甲基化位点变化在低温胁迫中作用的方法

说明书

本发明涉及一种确定马铃薯StALDH基因甲基化位点变化在低温胁迫中作用的方法，包括低温胁迫下StALDH基因DNA甲基化位点变化分析、低温胁迫下StALDH基因表达量水平分析和NbALDH在植物发育及响应低温胁迫中功能分析的步骤。本发明从表观遗传学领域研究马铃薯响应低温胁迫机理、筛选分离响应低温胁迫相关基因及其甲基化位点变化，进而培育耐冷抗冻马铃薯品种，可抵御骤然低温对马铃薯生产造成的不良影响，拓宽了马铃薯耐受低温胁迫的研究，对保障我国马铃薯高产稳收，有着非常重要的理论基础与现实指导意义；同时，对DNA甲基化修饰在其它植物响应逆境胁迫中的作用研究提供理论参考。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种确定马铃薯StALDH基因甲基化位点变化在低温胁迫中作用的方法。

背景技术

马铃薯是世界第三大重要农作物，仅次于小麦和水稻。在人口增长、耕地面积减少、水资源不足的影响下，我国食物安全存在着潜在危机。马铃薯产业的不断发展，将对缓解我国食物安全压力起到重要作用。我国是马铃薯生产大国，面积占世界马铃薯种植面积的1/4，产量占1/5，在世界举足轻重。内蒙古自治区是我国马铃薯生产的大区，由于其特有的气候条件，目前已经成为马铃薯种薯及商品薯繁育的主产区。

低温胁迫是限制马铃薯生产过程中经常遇到的灾害，常常会引起马铃薯大面积减产，严重制约了马铃薯的丰产增收。在内蒙古自治区低温天气经常发生于早春和晚秋，马铃薯遭受低温危害的报道屡见不鲜，轻者影响当年马铃薯产量和品质，重者甚至导致马铃薯绝产。遭受低温危害的马铃薯更容易受到病虫害的侵染，导致二次减产，对当地马铃薯产业和薯农损失严重。怎样提高马铃薯对低温的耐受性，已成为关系到马铃薯能否正常生产的关键问题之一。

目前，对马铃薯耐受低温研究大都利用耐受低温材料进行研究，但这样的耐受低温材料资源相对狭窄，因此，限制了马铃薯耐受低温基因的挖掘及培养耐受低温品种。

表观遗传修饰主要是研究DNA序列不发生改变的可遗传的基因表达调控。研究表明，表观遗传修饰在生物生长发育和逆境胁迫反应过程中起着极其重要的作用。生物的表观遗传修饰主要包括DNA甲基化修饰、组蛋白修饰、非编码RNA的调控作用等方面。近年来，有关表观遗传学的研究愈来愈成为基因表达调控研究的热点之一。DNA甲基化是表观遗传的重要修饰之一，是广泛存在于真核生物中的一种表观遗传修饰，即在逆境、发育等过程中，虽然核苷酸序列没有发生变化，但基因表达调控发生了变化，通过对基因甲基化或去甲基化来调控基因表达进而响应逆境胁迫。

目前，通过DNA甲基化修饰研究植物响应逆境胁迫的研究大都仅限于逆境胁迫后基因组DNA水平甲基化状态的变化研究，但DNA甲基化修饰如何调控植物响应逆境胁迫的分子机制尚不清楚。

我们前期的研究发现，低温处理下马铃薯乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)基因甲基化水平增加。ALDH酶作为随机组合的四聚体酶，广泛存在于原核生物和真核生物能量代谢旺盛的器官中，在辅酶Ⅰ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)的参与下对外源性或内源性乙醛、4-羟壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)等醛类物质的脱氢氧化代谢发挥重要作用。ALDH是植物非正常呼吸链的重要水解酶，对乙醛代谢有显著的调控作用，是植物对逆境胁迫的一种代谢性调节。植物在遭受低温胁迫时，活性氧物质(ROS)在细胞内大量积累，打破平衡状态，从而造成氧化胁迫，活性氧物质直接损伤蛋白质、氨基酸和核酸，使细胞结构和功能受到破坏，导致膜过氧化和脱脂化，从而产生一些如醛类、羟类和酮类等高活性的有毒化学物质，最终导致细胞衰亡。而ALDH可催化醛类物质氧化成羧酸，清除有毒的醛类并减少脂类的过氧化反应，提高植物抗寒性。但到目前为止，鲜有报道马铃薯在低温胁迫下ALDH基因甲基化位点如何变化，以及该基因甲基化水平变化后基因表达水平发生了怎样的变化，甲基化变化如何响应低温胁迫及基因甲基化水平变化后对低温胁迫的耐受性如何，这些问题都没有进行深入的研究。

发明内容