[发明专利]一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法及接种装置

权利要求书

1.一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1，接种装置消毒；

步骤2，YEB培养基配制，5g/L牛肉膏粉末，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，1g/L酵母提取物，0.5g/L MgSO₄•7H₂O，15g/L琼脂粉（液体培养基不添加），加ddH₂O溶解，高温高压灭菌：121℃高温高压15min，待培养基冷却至60℃左右再加所需抗生素，之后将在每个100 mm培养皿中倒入30 mL培养基，冷却凝固备用；

步骤3，渗透液配制，MES 10 mmol/L , MgCl₂10 mmol/L，乙酰丁香酮（AS）200 μmol/L，现配现用；母液配制如下：MES（1 mol/L），用dd 水配制，调pH值（加NaOH）至5.6，过滤除菌；MgCl₂（1 mol/L），用dd H₂O配制，过滤除菌；乙酰丁香酮（100 mmol/L），称取0.3924 g乙酰丁香酮（As）溶于二甲基亚砜（DMSO），用DMSO定容至20 ml，布氏滤器（装有机滤膜）过滤除菌,-20 ℃保存；

步骤4，培养单菌落，将携带目的基因的农杆菌在步骤2中配制的YEB平板培养基上划线，于28 ℃黑暗培养16-30 h，直至长出单菌落；

步骤5，扩大培养，挑取步骤4中YEB培养基上长出的单菌落，将其放于步骤1中配制的YEB液体培养基中，于28 ℃，200 rpm，黑暗振荡培养16-24 h，直至其OD值为0.6-0.8，最大OD值不能超过1.0；

步骤6，制备菌体悬浮液，将菌液置于50mL无菌离心管中，离心（4000 rpm，15 min，4℃）去上清，收集菌体，用步骤3中配制的渗透液重悬菌体，使菌液的OD值达到1.5-1.8；

步骤7，烟草叶片接种，将步骤6中制备好的菌体悬浮液装入步骤1中已消毒的储液管中，把烟草叶片置于装置底座上，按压手柄使接种头上的滚珠针头挤压烟草叶片造成伤口，针头中滚珠挤压上抬，菌液从针管中流出到叶盘伤口处，抬起手柄即完成一次接种，根据叶片大小更换位置接种；

步骤8，培养接种烟叶植株，将烟草植株放在25 ℃，65 %-75 %湿度，黑暗24h后，再放入以下环境中培养：光照14 h，25 ℃，65 %-75 %湿度，黑暗10 h，25 ℃，65 %-75 %湿度，45天烟草植株可开花。

2.根据权利要求1所述的烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法，其特征在于：步骤5中，YEB液体培养基中需要加入农杆菌及携带目的基因载体的抗性抗生素。

3.根据权利要求1所述的烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法，其特征在于：步骤7中，在烟草小苗4片真叶时期接种最佳，将4片真叶都接种效果更佳。

4.一种权利要求1 所述的烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法的接种装置，其特征在于所述的接种装置包括可按压手柄、接种头、底座以及带盖的钢化玻璃储液管，可按压手柄的两个头分别与接种头和底座焊接，储液管与接种头连接，接种头上装有数个滚珠针头，接种头内部中空与滚珠针头和储液管接通。

5.根据权利要求4所述的接种装置，其特征在于：所述的带滚珠针头的接种头为3cmx3cmx 0.5cm内部中空的金属方盒。

6.根据权利要求4所述的接种装置，其特征在于：所述的带有滚珠的针头10x10根均匀分布于接种头上，针头长0.5cm，直径0.1cm。

7.根据权利要求4所述的接种装置，其特征在于：所述的带盖的钢化玻璃储液管为圆管，高5cm，直径3cm，连接一面设有接口，与接种头接口对接。

8.根据权利要求4所述的接种装置，其特征在于：所述的底座为钢铁材质，尺寸为3cmx3cmx0.2cm。

9.根据权利要求4所述的接种装置，其特征在于：所述的可按压手柄长7.5cm。