[发明专利]一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法及接种装置

说明书

本发明是一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法及接种装置。本方法通过：接种装置消毒；YEB培养基配制；渗透液配制；培养单菌落；扩大培养；制备菌体悬浮液；烟草叶片接种；培养接种烟叶植株等8个步骤完成，本发明针对为大批量烟草叶片接种携目的基因的农杆菌，利用新型植物叶片接种菌液装置，快速便捷地为大批量、规模化的烟叶接种农杆菌。与传统常用方法相比，不仅提高了工作效率、保证了接种效果，还节省了人力与材料。

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体地说是一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法接种装置。

背景技术

携带目的基因植物表达载体的农杆菌侵染植物宿主，利用农杆菌介导，将含目的基因的植物表达载体转入到植物受体细胞中，使目的基因在受体细胞中表达，这是在转化植物细胞中一种被广泛利用的方法。为研究该目的基因在整体植株上的表达及影响时，需要为植物叶片接种携带该目的基因植物表达载体的农杆菌，常用的接种方法有涂抹接种法、刺伤接种法和注射接种法。涂抹接种法，需要用渗透液悬浮菌体，并加入SilwetL-77和研磨细碎的石英砂，再用毛笔或其他工具将菌体悬浮液涂抹在叶片上。刺伤接种法，同样配制菌体悬浮液，用针头或其他尖锐工具划伤植物叶片，再将菌体悬浮液涂抹在伤口处接种。注射接种法，配制菌体悬浮液，用去掉针头的注射器吸取菌体悬浮液，抵住叶片背面将菌液挤压浸润到整个叶片以接种。

这几种常用办法各有优劣，涂抹接种法较方便快速，但接种效率不高；刺伤接种法效率良好，但步骤繁琐；注射接种法，效率较高，但耗时耗力耗材料。应用时需要根据接种的植物材料及数量来选取不同的接种方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法及接种装置。

本发明的技术方案如下：

一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法，包括如下步骤：

步骤1，接种装置消毒；

步骤2，YEB培养基配制，5g/L牛肉膏粉末，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，1g/L酵母提取物，0.5g/L MgSO₄•7H₂O，15g/L琼脂粉（液体培养基不添加），加ddH₂O溶解，高温高压灭菌：121℃高温高压15min，待培养基冷却至60℃左右再加所需抗生素，之后将在每个100 mm培养皿中倒入30 mL培养基，冷却凝固备用；

步骤3，渗透液配制，MES 10 mmol/L , MgCl₂10 mmol/L，乙酰丁香酮（AS）200 μmol/L，现配现用；母液配制如下，MES（1 mol/L），用dd 水配制，调pH值（加NaOH）至5.6，过滤除菌；MgCl₂（1 mol/L），用dd H₂O配制，过滤除菌；乙酰丁香酮（100 mmol/L），称取0.3924 g乙酰丁香酮（As）溶于二甲基亚砜（DMSO），用DMSO定容至20 ml，布氏滤器（装有机滤膜）过滤除菌,-20 ℃保存；

步骤4，培养单菌落，将携带目的基因的农杆菌在步骤2中配制的YEB平板培养基上划线，于28 ℃黑暗培养16-30 h，直至长出单菌落；

步骤5，扩大培养，挑取步骤4中YEB培养基上长出的单菌落，将其放于步骤1中配制的YEB液体培养基中，于28 ℃，200 rpm，黑暗振荡培养16-24 h，直至其OD值为0.6-0.8，最大OD值不能超过1.0；

步骤6，制备菌体悬浮液，将菌液置于50mL无菌离心管中，离心（4000 rpm，15 min，4℃）去上清，收集菌体，用步骤3中配制的渗透液重悬菌体，使菌液的OD值达到1.5-1.8；